非冻型血液RNA保存液

非冻型血液RNA保存液
Blood  RNA LOCKER
产品及特点
由于血液富含 RNase，因此血液 RNA 非常容易降解，是临床分子生物学研究中的一个棘手的问题。为解决此问题，本公司在非冻型组织 RNA 保存液
的基础上，开发了本产品，它具有下列特点:
1. 能快速渗透到新鲜血液细胞内，抑制 RNA 分子的降解。保存的血液 RNA常温可放置 3 天，4℃可放置 5 天，-20℃可放置 3 个月。
2. 操作简单，直接将本产品和新鲜血液细胞沉淀按比例混合即可。
3. 适用于人新鲜血和哺乳动物新鲜血液，不适用于陈旧血液和冻凝血液，也不适用于禽类血液和其他动物血液。
4. 重复性好，效果跟进口同类产品相当。
5. 保存的样品可直接用本公司血液 RNAout 提取 RNA。
非冻型血液RNA保存液规格及成分
成 份
10 mL 塑料袋 包装
100 mL  塑料袋 包装
本产品  10 mL  100 mL
使用手册  1 份  1 份
运输及保存
常温运输和保存，有效期两年。
自备试剂 无。
使用方法
注意：e RNase  污染无处不在，最好用本公司的高效无毒固相 e RNase  清除剂处理 理  RNA  工作区域，千万不要使用烷基化试剂  DEPC （相当于）。
一: : 以 白 细胞 为材料的保存方法（此 法效果好于全血保存法）
1. 室温 1500-2000 g 离心新鲜抗凝血液 10-15 分钟，最上层为血浆，最下层为红细胞，中间层为膜状的、含白细胞的 Buffy Coat（含白细胞多的血
液此层可能很厚）。
2. 吸出血浆后，小心将中间的白细胞层吸出（允许污染部分红细胞）到新的离心管中，加入 5-10 倍体积的本产品，混匀后放常温（不超过 30℃）保
存不超过 3 天或者放-20℃保存 3 月(放-20℃前需要现在 4℃放置过夜，然后再离心去除保存液，最后再把细胞沉淀放到-20℃。如果直接放入
-20℃，冰晶会刺破白细胞，释放出其中的 RNA，在后续实验去掉上清时会丢失)。
二：以  EDTA  抗凝全血为材料的保存方法
3. 将血液取到 EDTA 抗凝管中后，迅速将 0.5 mL 血液与 1.5 mL 本产品混合，充分颠倒混匀，然后放常温（不超过 30℃）保存不超过 3 天或者放
-20℃保存 3 月(放-20℃前需要现在 4℃放置过夜，然后再离心去除保存液，最后再把细胞沉淀放到-20℃。如果直接放入-20℃，冰晶会刺破白细
胞，释放出其中的 RNA，在后续实验去掉上清时会丢失)。
三 ： 血液  RNA  的提取（ 本产品不含  RNA  提取试剂。 此处 以 本公司的跟  Trizol相当的 动物 t RNAout  操作步骤为参考 。 用户 也可以使用其他  RNA  纯化试剂）
4. 提取 RNA 时，如果保存的白细胞在-20℃，则需要先室温化冻，如果保存在常温或 4℃，则直接使用。
5. 取 1.8 mL 混合液到新的 2 mL 离心管中，5000 g 室温离心 1 分钟。
6. 小心吸弃上清液（本产品），细胞将形成沉淀（如果样品时全血，沉淀中将含有大量血液蛋白）。注意：上清一般会很浑浊，一定要尽可能弃尽。有时沉淀上面有白色晶体出现，属于正常现象。
7. 在细胞沉淀中加入动物 RNAout 1 mL 溶液 A，剧烈震荡 30 秒（不能感觉到震荡即可，一定要看见管底液体旋转起来，否则只是液体表面的震动，
下同）。震荡后颠倒几次看溶液是否均匀，如果有颗粒状物体说明还需要震荡裂解。
8. 室温放置 5 分钟以使细胞充分裂解。
9. 将 0.2 mL 自备的氯仿加入到离心管中，剧烈震荡 30 秒。
10. 12000-15000 g 4℃离心 3 分钟。一般上清为无色的水相（含 RNA，约0.5-0.9 mL）；中间层为白色，含有 DNA、蛋白质和其他细胞破碎物，不要触及；下层为有机相，一般呈深红色。注意：有时水相比重大于有机相，出现反相现象，此时应该取下面的水相。
11. 小心将水相转移到另一自备的 1.5 mL 塑料离心管中。如果水相超过 0.75mL，则需要分成 2 管，否则在下步没法加入等体积的异丙醇。
12. 加入等体积的异丙醇到水相中，充分颠倒混匀。
13. 12000-15000 g 4℃离心 10 分钟沉淀 RNA。
14. 吸弃上清。注意：如果离心后出现两个相，则需要吸弃上面的一相，然后在下相（含 RNA）中加入一倍体积的超纯水和一倍体积的异丙醇，混匀后 12000-15000 g 4℃离心 10 分钟沉淀 RNA，吸弃上清。
15. 将75% RNase-free乙醇加入到RNA沉淀中，震荡几秒后12000-15000g 4℃离心 1 分钟。
16. 弃上清
17. 12000-15000 g 4℃离心半分钟，用移液枪去除残留的液体。
18. 将 20-50 uL DEPC 处理的水加入到沉淀中并吹打溶解，立即用于下述完整性、产率和纯度的检测，也可直接用于后续 RT-PCR 等试验或存放于-80℃待用。
四:  RNA  的检测 （列出步骤仅供参考 ， 本产品不提供相关产品）
19. RNA 完整性的电泳检测：强烈建议用户使用甲醛变性胶进行 RNA 电泳，因为非变性胶中单链 RNA 分子会自生折叠成各种形状，尤其不能使用
DNA 上样液，因为没有经过去 RNase 处理。
20. RNA 产量产率测定：将 5-10 μL RNA 用 TE 缓冲液 (pH8.2)稀释 10 倍后检测其在 OD260 的光吸收。通过光吸收可以得出 RNA 浓度（1 OD260
的 RNA=40 μg/mL），进而计算出 RNA 的产量（浓度 X 体积)和产率(RNA产量/组织用量)。人血 RNA 产率一般为 2-5 ug/mL。
21. RNA 纯度测定：无污染的总 RNA 的 OD260/OD280 一般在 2.0 左右(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表
示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响 RT-PCR 等反应。
非冻型血液RNA保存液关联产品
膜结合 DNA 清除剂，固相 RNase 清除剂，
液相 RNase 清除剂，一站式 RNA 电泳套装。