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- LMAI Bio
- 美国/中国
- LM755Hu01
- 2025年07月10日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
避免反复冻融。2-8°C不超过一个月，-80°C不超过12个月
- 保质期：
1年
- 英文名：
Recombinant Peroxiredoxin 5 (PRDX5)
- 库存：
30
- 供应商：
联迈生物
- 规格：
10µg/50µg/200µg/1mg/1g
| 来源 | 原核表达 |
| 宿主 | E.coli |
| 内毒素水平 | <1.0EU/µg(LAL法测定) |
| 亚细胞定位 | n/a |
| 片段与标签 | N-terminal His Tag |
| 缓冲液成份 | 磷酸盐缓冲液（pH7.4，含有 0.01% SKL, 1mM DTT, 5% Trehalose和Proclin300.） |
| 性状 | 冻干粉 |
原理：
蛋白质的翻译效率很大程度上跟翻译起始效率有关，因此mRNA的5'端必须得很好翻译，最好不要有复杂的二级结构；通过PCR的方法在基因的5‘端引入简并序列，构建克隆，挑选多个克隆，诱导表达之，SDS-PAGE电泳检测表达量的高低，挑选高表达克隆进行测序。
实验步骤：
1.设计目的重组蛋白质的N端10-15个氨基酸的简并序列。
2.引物合成上述简并序列，同时设计合成目的基因反向引物。
3.PCR扩展目的基因，这样在目的基因的5‘端就引入了兼并序列，同时不改变氨基酸序列。
4.双酶切，插入到目标载体。
5.转化。
6.挑选多个克隆（比如100-200个）到1.5ml EP管，直接诱导表达（记得带上为改造克隆菌株的对照）。
7.SDS-PAGE检测。
8.挑选高表达的多个克隆，测序。
重组蛋白的特性
Immune tech的重组蛋白分为冻干粉和溶液态两种保存形式，原核细胞表达的重组蛋白为冻干粉状态，真核细胞表达的重组蛋白为溶液态保存，这样使得重组蛋白非常稳定，在-80℃条件下可保存数年。冻干粉在使用前需进行溶解，其中溶解的方法非常关键，因为溶解不好会降低蛋白的效用。溶液态保存的重组蛋白在冻融稀释使用过程中也需要仔细注意，这些都是用户在实际应用中经常遇到的问题。
（1）原核细胞表达的重组蛋白。Immune tech大肠杆菌表达的冻干重组蛋白，已经从包涵体中提纯，添加了蛋白保护剂，使用过滤后的无菌水作为复溶剂即可，复溶冻干蛋白100 μg，用86 μl的超纯水，轻轻摇晃使蛋白溶解，再用移液枪的枪头轻吹几下即可完全溶解，一定不能使用涡旋仪进行快速振荡或剧烈摇晃。
（2）真核细胞表达的重组蛋白。有活性的蛋白质不仅要转录和翻译，还要进行翻译后的加工，使得蛋白质的空间折叠方式维持正常，所以重组蛋白必须在真核细胞中进行，如哺乳动物细胞能够识别和去除基因中的内含子，对翻译后的蛋白质进行加工，这样表达的蛋白质具有生物活性。我们用溶液态来保存，保持了其良好的活性和稳定性。
（3）重组蛋白的保护剂。在冻干和储存过程中常用的保护剂或稳定剂有糖类，多元醇，聚合物，表面活性剂，某些蛋白和氨基酸等。我们通常加8%（质量比体积）的海藻糖和甘露醇作为冻干保护剂。海藻糖可明显阻止蛋白质二级结构改变以及冻干过程中蛋白质的伸展和聚集，甘露醇也是一种普遍应用的冻干保护剂和填充剂。
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文献和实验4. 氧化还原以促使二硫键的形成 为促使蛋白的二硫键的正确形成，可以在透析液中加入氧化剂和还原剂继续透析，经常用的氧化还原剂为氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽，比较经济的方法是使用 CuSO4 或 NaSeO3 ,但使用这种方法所形成的不正确的二硫键比前者高。因此本论文中使用氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽。 1) 如上制备透析液，但加入氧化还原剂，于4℃保存（其中还原性谷胱甘肽和氧化性谷胱甘肽的浓度
义翘神州日前曾邀请杨嘉慧博士进行了一场题为「获得高品质重组蛋白实验方案以及经典案例分析」技术公开课，课后收到了很多专业的提问，现将相关的问答简单列举一些，希望能够帮助更多的人获得高质量的重组蛋白。1. 是不是质粒片段越大转染效率越低?解答：一般情况是这样的，质粒片段越大，转染效率越低，但这也与表达宿主有关，不能一概而论。所以有时在进行表达载体优化时，会将质粒的片段或非重要功能区的一些片段进行删减，可以获得较好的转染效率。2.HEK293 瞬转表达重组蛋白相对于 CHO，哪个更有优势？解答
问：请问各位高手，我想让酵母蛋白酶Ａ失活，决定采用ＰＣＲ进行ＤＮＡ序列的突变，此法行的通吗？可有前人研究过？ 答：国外有了"蛋白酶缺失"的用于重组蛋白表达的菌株。国内也许也有，小龙对于上游不大懂，不知道自己构建蛋白酶缺失的酵母菌是否有技术上的难度。参见一篇综述《生命的化学》2003 年23 卷1 期CHEMISTRY OF L IFE 2003，23(1) 酵母表达系统及其应用研究。 假如只是为了降低重组蛋白表达时被水解的可能，在提取液中加入蛋白酶抑制剂如PMSF可以部分解决。
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