无缝克隆试剂盒厂家直销

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名称：无缝克隆试剂盒厂家直销
产地：国产|进口
编号：BTN160680
品牌：百奥莱博
规格：25次
无缝克隆是一种简单、快速、高效的DNA 定向克隆技术，该技术突破传统，不依赖内切酶和连接酶，不受限制性内切酶酶切位点的限制，利用同源重组的原理，可将任何DNA片段克隆至任何载体的任何位点。反应及转化时间短，阳性率达95%以上。

产品特点：
1. 简单、高效地定向克隆DNA片段。
2.可同时定向克隆两个或多个DNA片段。
3. 不依赖内切酶和连接酶，不受限制性内切酶酶切位点的限制。
4. 省时，反应时间加转化时间短至20分钟。
5. PCR产物(仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体)可直接进行重组反应，无需纯化。

试剂盒组成：

 

成分	规格
2×Seamless Mix	125μl
阳性对照DNA片段I	10μl
阳性对照DNA片段II	10μl
阳性对照线性化载体	10μl
超纯水	1ml
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

1. 线性化载体的制备：
 可通过单酶切、双酶切或PCR扩增的方法来制备。(如果线性化不彻底，将会导致阴性克隆的产生，推荐使用双酶切或PCR扩增的方法。)
2. DNA片段的制备：
 1)DNA片段可通过PCR扩增或酶切的方法制备，PCR扩增片段无需纯化即可用于重组反应。
 2)PCR扩增法引物设计原则：
  A.引物的3´端必须包含18-50个能与模板DNA 结合的碱基序列，以便PCR扩增出目的DNA片段。
  B.引物的5´端必须包含15-80个与线性化载体末端同源的碱基序列，以便PCR扩增片段能与线性化载体进行重组反应。
3. 重组反应：
 1)按照如下体系操作：
 2)50℃反应15分钟，然后将离心管放置于冰上。如当天不进行转化实验，请将连接产物放-20℃保存。
 注：线性化载体建议使用20-60 ng，DNA片段按照与线性化载体摩尔比3：1使用。
4.转化：
 1)取5μl连接液至50-100μl 刚刚融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴2-30分钟。
 2)42℃水浴热激30秒。
 3)立即放置于冰上静置2分钟。
 4)加入300-500μl 无菌SOC或LB培养基(不含抗生素)，37℃，200-250rpm 振荡培养60分钟。
 5)吸取 200μl菌液涂板，为得到更多克隆，可先3000 g离心2分钟，弃掉部分上清，用移液器轻吹菌体，至充分悬浮，取全部菌液涂板，然后37℃培养过夜(12-16小时)。
5. 用菌落PCR、直接测序或其他方法鉴定重组子。
6. 阳性对照反应(可选)
 将本试剂盒提供的阳性对照DNA片段和线性化载体按如下体系操作：
阳性对照DNA片段I(600bp，20 ng/μL)

或阳性对照DNA片段I(900bp，30ng/μL)

1μl
阳性对照线性化载体(2.8kb，30ng/μL)	1μl
2×Seamless Mix	5μl
超纯水	3μl

 50℃反应15分钟，然后按照步骤4转化涂板后用菌落PCR、直接测序或其他方法鉴定阳性重组子。

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