p_Amersham WB buffer strips (2

【求助】目标产物表达量低，普通PCR P不出来

条件以前做出过来一次，以后就再没做出来过。模板量及退火温度等相关因素能调的我都试过了，可是就是没结果。正常细胞中的TLR4表达量是不高，但是之前做出来过，现在重复不出来，而且以前做的瞬转质粒knock downTLR4表达细胞中，WB检测也出国结果。问题是现在这些都做不出来了。 如果用realtime PCR要怎么做呢，我之前没做过，能否指教一下？ zjubell 拿一个TLR4的已知序列，比如以前P出来的PCR产物，10倍稀释梯度，去做标准曲线，以及做为阳性

磷酸化蛋白 WB 做不好？文献指出了你可能忽略的重要原因

-1 的酪氨酸磷酸化（P-Cav-1）被发现是由 p38 丝裂原活化激酶和 c-Src 激酶的激活介导的[6] 。当使用 Triton-X-100 和 RIPA 提取 NIH3T3 细胞时，在可溶性组分中未检测到 caveolin 蛋白，仅在不可溶性部分[7]和下图（RIPA 不可溶组分但 SDS 可溶组分）中检测到。 也就是说如果在这种情况下使用 RIPA 可溶性组分来检测 P-Cav-1 将无法被检出。对于特定时间的特定样品，磷酸化和非磷酸化蛋白质的总和代表该特定蛋白质的总量。在相同的 WB 检测中

2-D Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Thiourea 2 g Chaps 0.5 g Mega 10 0.5 g OBG 250 µl Triton X-100 0.25 g Tris 0.4 g DTT 500 µl Pharmalytes or IPG buffer pH 3-10 (Amersham) 500 µl  - mercaptoethanol 4.Add 10 µl tributylphosphine 2 mM,under the hood (2 mM final conc.) 5.Add