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- 2025年07月11日
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文库/载体构建
| 基因文库构建服务 * 基因组文库构建 * cDNA 文库构建 |
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文献和实验）以及Gateway BP Clonase酶混合物。接着转化进大肠杆菌中，您将会获得包含目的基因的入门克隆，同时目的基因两侧具有attL重组位点。这个入门克隆可以与任何Gateway目的载体进行重组（参看图2）。 3、Gateway改造过的cDNA文库 如果您已经有了用Gateway兼容载体构建的cDNA文库，您就可以通过pDONR载体和BP Clonase酶混合物进行一个简单的重组反应，很容易地把单个克隆转换成Gateway入门克隆。这样就不再需要亚克隆和测序，为您节约数小时的时间
携带cas9的载体提供。这两种模式载体均携带有额外的抗性筛选标记。 2、gRNA文库扩增 上述构建的载体数量较少，不足以进行文库的慢病毒包装和使用。因此，需要对上述载体进行扩增，增加总量。上述gRNA载体构建完成后，我们将这些载体按相同的比例混合成一个pool（即载体混合库），随后将载体混合库使用专用电转感受态，电转扩增培养并收集菌落，并进行扩大培养，最后抽提质粒，即得到了扩增后的载体混合库，也就是文库。 3、gRNA文库慢病毒包装 扩增后的gRNA文库在慢病毒包装载体的辅助下转染293
，就可以进行后续操作了。六、文库克隆数的确定基因组DNA文库需要包含足够多的克隆，来保证文库的代表性。一般使用如下的经验公式来确定：N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P是希望得到的覆盖率，f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值，N是所需的克隆数。举例来说，用BAC载体构建人类基因组文库，人类基因组大小为3 x 109 bp, 插入片段大小为100kb，希望覆盖率99%，那么所需要的BAC克隆数为：N = ln (1 - 0.99) / ln (1 - [106bp / 3 x 109
