WE0154型BaldStar TaqMan Mixture

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北京百奥莱博专业生产供应WE0154型BaldStar TaqMan Mixture(dUTP+UNG酶)厂家，我公司销*(代"售")全品类的分子生物学试剂，价格优惠，欢迎广大科研工作者垂询订购。

名称：WE0154型BaldStar TaqMan Mixture(dUTP+UNG酶)厂家
编号：WE0154
英文名：BaldStar TaqMan Mixture(dUTP+UNG)
品牌：百奥莱博
规格：1ml|5ml
  本品是专用于探针法(TaqMan，Molecular Beacon等)实时荧光定量PCR的预混体系，浓度为2×，包含 BaldStar Taq DNA polymerase、PCR Buffer、dNTPs(dTTP全部被dUTP所取代)、UNG酶和Mg2+，操作简单方便。主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后的cDNA靶序列的检测，如基因表达分析，拷贝数分析，SNP基因型分析等。本产品中运用了dUTP-UNG防污染系统，在PCR反应体系配制过程中加入了dUTP，因此就形成了含有dU碱基的扩增产物。而此产物可以在下次进行PCR反应前，由PCR体系中的UNG酶处理消除。这样就有效的去除了PCR产物的残留污染，大大降低了由于扩增产物污染而导致的假阳性。UNG酶在PCR循环中的预变性步骤即可被灭活，因此不会影响新的含dU碱基PCR产物的形成。本品含有的 BaldStar Taq DNA Polymerase是一种经化学修饰的、全新高效热启动酶，在常温下没有聚合酶活性，有效避免在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增，酶的激活须在95℃下孵育10分钟。独特的 PCR缓冲体系与热启动酶的组合，显著提高了PCR的扩增效率，荧光信号更强，灵敏度更高，可以检测单拷贝的模板。使用本产品可以得到更广的线性范围，对目的基因定量更准确。

  ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器(WE0154)：
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器(WE0155)：
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器(WE0156)：
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

产品组成：

 

组份	WE0154-5ml	WE0155-5ml	WE0156-5ml
2×BaldStar TaqMan Mixture(UNG)	5×1ml	5×1ml	5×1ml
50×Low ROX	-	200μl	-
50×High ROX	-	-	200μl
ddH2O	5×1ml	5×1ml	5×1ml

注意事项：
1、使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降。本产品长期保存可置于-20℃，避光。如果在短期内需要频繁使用，可在2～8℃保存。


使用方法：
以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系	终浓度
2×BaldStar TaqMan Mixture(UNG)	25μl	1×
Forward Primer，10μM	1μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	1μl	0.2μM
Probe，10μM	1μl	0.2μM
Template DNA	2μl
50×Low ROX or High ROX(可选)	1μl	1×
ddH2O	up to 50μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0μM作为设定范围的参考。
2)使用的探针浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
3)通常DNA模板的量以10-100ng基因组DNA或1-10ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
4)不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50× Low ROX or 50×High ROX。

2、PCR反应程序
注意！本产品预变性反应必须在95℃ 10分钟下完成！

两步法PCR：

步骤	温度	时间	循环数
UNG酶消化	37℃/50℃	2-10 min
预变性	95℃	10 min
变性	95℃	15 s	35-40个循环
退火/延伸	60℃	1 min

注意：
1)本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。
2)建议采用两步法PCR反应程序，若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增。

三步法PCR：

步骤	温度	时间	循环数
UNG酶消化	37℃/50℃	2-10 min
预变性	95℃	10 min
变性	95℃	15 s	35-40个循环
退火	55℃-65℃	30s
延伸	72℃	30s

储存条件：-20℃，避免反复冻融

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·TOP10感受态细胞
编号：WE0251
英文名称：TOP10 Competent Cell
规格：100μl×10支
  本产品是大肠杆菌TOP10菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。TOP10是一种常用于质粒克隆的菌株，其φ80lacZΔM15基因产物可与载体编码的β-半乳糖苷酶*基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。使用pUC19质粒检测，转化效率可达108，适用于高效的质粒DNA克隆并能保证高拷贝质粒的稳定复制。

产品组成：

组份	0.1ml×10支
TOP10 Competent Cell	10×100μl
Control DNA pUC19，0.1ng/μl	10μl

实验前准备及重要注意事项
1、感受态细胞一定要用干冰运输。感受态细胞应在-80℃下保存，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。
2、转化所有步骤均在无菌条件下操作。
3、包装中有0.1ng/μl的pUC19DNA，供对照试验使用。

使用方法：
1、取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。以下实验以50μl感受态细胞为例。
2、待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA(根据实际情况加入适量的DNA，通常100μl感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和)，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。
3、42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
4、向每个离心管中加入450μl无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45分钟使菌体复苏。
5、根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16小时。
注意：
1)涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA总量较少，可取200-300μl转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心(4000rpm，2分钟)后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。
2)新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。
3)涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

储存条件：-80℃。


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·一步法RT-PCR试剂盒
编号：WE0129
英文名称：UltraRT One Step RT-PCR Kit
规格：100次
  本试剂盒是专为一步法RT-PCR实验研制，逆转录和PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。本试剂盒包括全新高效逆转录酶、快速热启动DNA聚合酶，同时包含适用于逆转录和PCR扩增的反应缓冲液和实验中所必需的其它组分。UltraRT逆转录酶RNase H活性缺失，减少了逆转录反应中RNA的降解。该逆转酶逆转录效率高，可对少量RNA模板进行良好的逆转录反应。PCR反应使用的快速热启动DNA聚合酶具有扩增效率高、特异性强、延伸速度快的优良性能。独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。使用本试剂盒扩增得到的目的产物3"端附有一个″A″碱基，可直接用于T/A克隆。

试剂盒组成：

组份	100次
UltraRT OneStep EnzymeMix	50μl
2×UltraRT OneStep Buffer	1.4ml
RNase-Free Water	1.5ml

注意事项：
1、在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套。
2、实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC处理后进行高压灭菌。
3、本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。
4、本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好坏直接影响到RT-PCR 反应的结果，设计引物时需考虑GC含量，引物长度，引物位置，PCR产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件来设计。

使用方法：
1、将RNA模板、引物、OneStep RT-PCR Buffer、UltraRT OneStep RT-PCR EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2、根据以下表格配制反应体系：
 

试剂	25μl反应体系	终浓度
2×UltraRT OneStep Buffer	12.5μl	1×
Forward Primer，10μM	1μl	0.4μM
Reverse Primer，10μM	1μl	0.4μM
UltraRT OneStep EnzymeMix	0.5μl
RNA Template	Xμl	1 pg–1μg
RNase-Free Water	up to 25μl

注意：引物浓度请以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。

3、涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4、将热循环仪预热到45℃，将PCR管置于热循环仪中，进行RT-PCR反应。

反应条件：

步骤	温度	时间	循环数
反转录	45℃	30 min
PCR预变性	95℃	2 min
变性	94℃	30 s	30-40 个循环
退火	55-65℃	30 s
延伸	72℃	30 s
终延伸	72℃	5 min

注意：
1)一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为20-30秒，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
2)延伸时间根据扩增的片段大小设定，本产品中包含的DNA Polymerase扩增效率为1 kb/30s。
3)可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少，扩增量不足；循环次数多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。

5、反应结束后取5μl反应产物，加入适量上样缓冲液后进行电泳检测结果。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。


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·显影粉
编号：WE0303
英文名称：Developing Powder
规格：20套

·HRP标记驴抗鸡IgY(IgG)(H+L)
编号：WE0370
英文名称：Donkey Anti-Chicken IgY(IgG)(H+L),Peroxidase Conjugated
规格：100μl
本产品为过氧化物酶标记的经亲和纯化的驴抗体，特异识别鸡IgY，检测灵敏度高，本底低，可用于Western Blot、ELISA和免疫组化检测。酶标记抗体，是一类广泛用于免疫学、分子生物学及临床医学各个分支学科中的免疫化学制剂，具有特异、敏感和安全的特点。

免疫原：鸡IgY
缓冲液：0.01M PBS，50%甘油，pH7.6
稳定剂：15 mg/ml BSA(不含IgG和蛋白酶)
防腐剂：无(叠氮*是HRP抑制剂，抗体稀释液中请避免使用叠氮*作为防腐剂)
应用范围：
WB ECL发光检测(1：10000-200000)
WB 显色检测(1：5000-100000)
ELISA(1：5000-100000)
Immunohisto/Cytochemistry(1：500-5000)

·蛋白快速染色液
编号：WE0278
英文名称：FastStain Protein Staining Reagent
规格：500ml
  本产品采用独特的配方，可对电泳后凝胶上的蛋白质条带进行染色，而对凝胶本底几乎没有着色。染色过程仅需15分钟，染色后几乎不需要脱色。本产品灵敏度高，可检测到15ng BSA蛋白；若实验对检测灵敏度有较高要求，可将凝胶放置在染色液中2小时，可达到最大灵敏度(BSA：5ng)。

注意事项：
1、操作时请务必佩戴手套，如溅到皮肤上，请立即用大量水冲洗。
2、染色前的凝胶洗涤非常重要，否则会造成凝胶染色背景加深。
3、如染色后有轻微背景，可将染色后的凝胶用过量蒸馏水室温洗涤、脱色。
4、本产品适用于变性和非变性凝胶电泳后的蛋白染色。

操作步骤：

I 常规操作步骤：
1、常规PAGE电泳完成后，小心取下凝胶，根据凝胶的大小，将其放置在一个可微波加热的容器中。
2、加入足量的纯水，使凝胶可以在其中自由晃动，微波加热至沸腾。室温晃动2 min，彻底弃去水。
3、取20-25ml(以液面刚好覆盖凝胶为宜)凝胶染液加入到纯水洗涤后的凝胶的盒中，使其足以没过凝胶，轻轻晃动。并在微波炉中高火加热至沸腾，取出后室温轻轻摇动，5-10 min后凝胶中的蛋白条带开始显色，15 min后显色基本完成。
注意：此操作检测的灵敏度为：用BSA检测，灵敏度为15ng。若实验对检测灵敏度有较高要求，可将凝胶放置在染色液中2小时，可达到最大灵敏度(用BSA检测，灵敏度为5ng)。

II 快速助染步骤：
1、常规PAGE电泳完成后，小心取下凝胶，根据凝胶的大小，将其放置在一个可微波加热的容器中。
2、加入足量的纯水，使凝胶可以在其中自由晃动，微波加热至沸腾。室温晃动2 min，弃去水。
3、重复步骤2两次。
4、取20-25ml(以液面刚好覆盖凝胶为宜)凝胶染液加入到含纯水洗涤后的凝胶的盒中，使其足以没过凝胶，轻轻晃动后，微波高火加热至沸腾，取出后置于室温并轻轻晃动，5-10 min后凝胶中的蛋白条带开始显色，15 min后显色完成。
注意：此操作检测的灵敏度为：用BSA检测，灵敏度为5ng。

储存条件：室温

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