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文献和实验CRISPR-Cas9 全程实操教程:从 gRNA 设计到挑单克隆全程指导
基本原理CRISPR-Cas9 是一种细菌获得性免疫,用于降解入侵的外源 DNA。CRISPR RNA (crRNA) 与转录激活 crRNA (Trans-activating crRNA, tracrRNA) 退火形成的复合物能特异性识别与其互补的基因组序列,引导 Cas9 核酸内切酶在目的片段生成 DNA 双链断裂,如下图所示。通过基因工程手段对 crRNA 和 tracrRNA 进行改造,将其连接在一起得到 sgRNA (single guide RNA)。通过将表达 sgRNA
editing. Nat Biotechnol 30(5):460–465. doi: 10.1038/ nbt.2170 12. Deveau H, Garneau JE, Moineau S (2010) CRISPR/Cas system and its role in phagebacteriainteractions. Annu Rev Microbiol64:475–493. doi: 10.1146/annurev. micro.112408.134123 13
并验证过激活功能。 成品文库同时可按需提供亚库,适合细胞量或预算有限的项目。 稳定细胞株构建服务 提供文库筛选所需的宿主细胞准备:Cas9 稳转株构建(含表达与切割活性双重验证)、感染条件与 MOI 实测、以及低代次冻存库建立。同时可协助评估细胞扩增能力是否足以支撑目标文库的覆盖度要求,在立项阶段就把可行性问题暴露出来。 --- 五、常见问题FAQ 细胞量不够,能不能降低覆盖度? 可以降低,但要清楚代价。覆盖度从 500 倍降到 100 倍,会显著增加随机噪声,弱表型基因的检出能力下降。更推荐
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