- ¥1000
- ATCC
- 美国
- AT1029
- 2025年07月12日
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- 详细信息
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- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
1年
- 英文名：
KM71H
- 库存：
20
- 供应商：
康朗生物
- 规格：
500ul甘油菌
基本信息
| 出品公司: | ATCC |
|---|---|
| 菌株类型: | 毕赤酵母 |
| 培养基: | YPD培养基 |
| 生长条件: | 28-30 ℃, 有氧 |
| 基因型: | aox1::ARG4, arg4 |
| 表型: | MutS, Arg+ |
| 抗性: | 氨苄和卡那 |
| 质粒转化条件: | 电转 |
| 应用: | 蛋白表达 |
| 诱导方法: | 甲醇 |
订购信息
| 产品编号 | 产品名称 | 规格 | 价格 |
|---|---|---|---|
| AT1029 | KM71H | 500ul甘油菌 |
¥1000.00 |
菌株特点
KM71H是毕赤酵母菌株，属于真核细胞。一般的针对原核生物的抗生素例如卡那和氨苄对酵母是无效的，因此为了防止大肠杆菌等原核生物对酵母培养菌株污染，往往会在培养基中加入一些氨苄和卡那霉素的抗生素，来抑制细菌菌的污染和生长。
毕赤酵母适宜的生长温度是28至30度，温度超过32度对蛋白的表达是有害的，并可能导致细胞的死亡。
KM71H毕赤酵母可以在YPD培养基中生长。
KM71H毕赤酵母被推荐用来表达含有Zeocin抗性的载体载体重组质粒，例如pPICZ A,B,C系列的载体。
在筛选KM71H重组转化菌株时，Zeocin抗生素的工作浓度是100 ug/ml。
KM71H宿主菌中的AOX1基因含有一个片段缺失，当pPICZ A,B,C或者pPICZα A,B,C转化到KM71H中时只能产生出MutS转化株，不必在进行Mut基因型的筛选了。
KM71H的来源母细胞在精氨琥珀酸裂解酶基因(arg4)含有一个突变,这使得菌株无法在不含有精氨酸的培养基中生长。而KM71H酵母细胞中在AOX1基因处插入了一个正常的arg4基因，从而形成了KM71H的MutS, Arg+ 表型。
将约2kb 的Arg4基因克隆出来后插入到KM71H来源菌株内的野生型的AOX1基因的BamH I（16 bp）和Sal I（227 bp）中间，从而构建成功KM71H。ARG4基因直接替换了AOX1基因 的16-227片段序列。
KM71H毕赤酵母细胞的优点是不需要利用甲醇minimal media筛选菌株的Mut基因型，因为所有的转化株都是MutS菌株。另外，AOX1基因并没有被完全删除，理论上你可以用自己的基因替换其中的Arg4基因，从而生成MutS, Arg-的转化株，但是由于实验表明该基因型酵母菌株在含有精氨酸的minimal media上并不能很好的生长，所以并不鼓励大家进行这种基因替换尝试。
1、安瓿瓶开封：用浸过75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端。
2、菌株恢复培养：用无菌吸管吸取0.3--0.5ml适宜的液体培养基，滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状。吸取全部菌体悬浮液，移植于1-2支建议的培养基试管中，并在建议的条件下培养。
3、注意事项：菌种活化前，请将安瓿管保存在6-10℃的环境下，某些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需要连续两次继代培养才能正常生长
4、复苏后的菌种在传1-2代后使用。
5、暂不启开的安瓿及复苏后需保藏的斜面应于4℃中保藏。
特别注意事项：
l、微生物菌种应保藏于低温、清洁和干燥的地方,室温放置时问过长会导致菌种衰退;
2、菌种操作应在无菌条件下进行,防止杂菌污染:
3、斜面菌种保藏时间通常为1-2个月,应根据菌种状况及时转接;冻干菌种保藏时间通常为5~10年;
4、菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降，应及时与我司销售联系或更换新的菌种。
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文献和实验纯的CaCl2 制备的感受态细胞，其转化率与进口的同类型试剂相比要低10-2 左右。同样对于保存细胞添加的抗冻剂甘油也应采用高纯度，在感受态细胞制备过程的所用器皿尽量酸洗后乙醇洗涤，超声后用超纯水淋洗。 2实验步骤 2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 （1）用牙签挑取少许大肠杆菌保藏液稀释划线于LB固体培养基上，37℃培养12～16h。 （2）挑取单菌落接种于30ml LB液体培养基中，37℃下培养12～16h。 （3）按1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于50mL LB培养基中
至总体积 10 ul混合后置 14～16 ℃ 水浴 6～12 h。【注意事项】1）通常 DNA 插入片段与载体 DNA 的摩尔比为 3:1 或 2:1，需根据 DNA 分子量计算，而不取决于浓度；2）平齐末端连接时，插入片段的量要远远大于载体 DNA 的量，可以为 5:1 或更多，即使这样，连接效率仍然很低。3）有时 DNA 一端是粘端，另一端是平端，这种连接与双酶切粘端连接相似；4）不匹配末端需要连接时，首先要将末端处理成平端，然后再进行连接反应。六、重组质粒的转化【实验目的】学习和掌握感受态细胞
型石油酵母Y11430突变 而来，常用的3株宿主菌是GS115，KM71 和 MC1o0-3。GS115和KM71是Y1 1430的组氨醇脱氢酶基因(histidinol dehydrogenase gene，h/s4)缺失突变体，不能合成 H/s4，因此质粒载体需携带h/s4，转染后的阳性重组子可以用h/s4缺陷 (h/s4-)平板进行筛选，但是GS115和KM71存在一定的低频率自发回变，即重新变为h/s正常菌株，致使h/s4’平板筛选阳性重组子存在假阳性情况。GS115的启动子为P，在含甲
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