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赫澎(上海)生物
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文献和实验DNA 样品,将未甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)。重亚硫酸盐处理不会影响甲基化的胞嘧啶(m5C) 。为了检测甲基化位点,一对引物经设计带有鸟嘌呤(G),可与目标序列中的 m5C 配对;为了检测未甲基化位点,另一对引物带有腺嘌呤(A),可与重亚硫酸盐转化分子中的U配对(随后,与后续 PCR 循环中的胸腺嘧啶(T)配对)。通过引物配对得到的阳性 PCR 扩增结果可用于确定位点的甲基化状态(图 7)。 图 7.甲基化特异性 PCR 第一步,使用重亚硫酸盐处理 DNA 样品,将未甲基化的胞嘧啶转化
脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变(见图1),行PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶,最后,对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化。此方法是一种可靠性及精确度很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态,但需要大量的克隆测序,过程较为繁琐、昂贵[27]。 图1:重亚硫酸盐处理过程示意图。DNA经重亚硫酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶不变,未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶 2.2.3 甲基化特异性的PCR(methylation
LightCycler通过实时荧光PCR技术进行DNA甲基化分析
的定量。 更多有关特定CpG位点的甲基化的详细信息,可采用重亚硫酸氢盐修饰后测序分析。 LightCycler主要应用:实时荧光PCR技术进行快速准确的DNA甲基化分析 我们使用罗氏诊断公司的LightCycler®480高分辨熔解扩增试剂盒在LightCycler®480实时荧光PCR仪上,通过MS-HRM测定法对两种已知的经过启动子(FANCE和MGMT)甲基化的DNA修复基因的检测性能。 材料和方法 将多种细胞株的DNA样本作为检测模板。每μg的每种DNA样本都经过重亚硫酸盐修饰
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