基因定点突变试剂盒优惠

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博专业生产销售基因定点突变试剂盒优惠，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：基因定点突变试剂盒优惠
编号：YT027
英文名：Site-directed Gene Mutagenesis Kit
规格：10次
产地：国产|进口
本试剂盒可以用于点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)。

本试剂盒是一个利用目前最新的基因点突变技术设计而成的试剂盒。只需通过基于PCR的突变质粒的合成，和基于Dpn I的模板质粒的消化，转化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考图1)。累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。



参考上图，使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的两个引物，在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模板，用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用甲基化酶Dpn I处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。这样把Dpn I处理过的产物转化细菌后，质粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。

本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。

试剂盒组份：

Pfu DNA Polymerase	10μl
Reaction Buffer(10X)	100μl
dNTP Mix(2.5mM each)	50μl
Dpn I	10μl
DH5α 甘油菌	200μl
Nuclease-Free Water	1ml

储存条件：-20℃，有效期一年。

使用说明：

1. 引物设计：
用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计：
(1) 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。
(2) 引物的长度通常为25-45个碱基。
(3) 引物中突变位点任何一侧都必需满足 4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数) ≥45。但引物也不宜过长，否则通常会形成非常稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右，且使两侧按照上述计算得到的数值相近。
例如引物为agtcaggccaattcgaagcagtcgaattgccaag，其中蓝色的aag为突变位点，则
左侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X7＝46≥45
右侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X8＝48≥45
(4) 在可能的情况下，尽量把引物的GC含量控制在40％-60％。
(5) 在可能的情况下，尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。二级结构和二聚体可以通过一些软件进行分析。
(6) 最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。

2. 引物的配制：
如果合成得到的一个引物A的量是20nmol，另外一个互补引物B的量是19nmol。在引物A中加入200微升水，配制成浓度为100µM，在引物B中加入190微升水也配制成浓度为100µM。吸取20微升100µM引物A和20微升100µM引物B到一新的离心管中，再加入160微升水，混匀后即可得到可以直接用于基因定点突变反应的引物(10µM each)。

3. 待突变模板质粒的选择：
选择GC含量在40-55％的待突变模板质粒，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。另外目的基因GC含量最好也在40-55％的范围，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的质粒模板，或者有局部高GC含量的质粒模板，请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。
必需使用从dam＋的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变。常用的大部分大肠杆菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。

4. 基因定点突变反应：
(1) 如下设置基因定点突变反应体系：
Nuclease-Free Water———>?µl
Reaction Buffer (10X)——>5µl
引物 (10µM each)————>2µl
dNTP Mix (2.5mM each)——>4µl
待突变模板质粒(0.5µg)——>?µl
总体积——————————>49µl
按照上面的顺序依次加入各种试剂。在上述反应体系中，根据待突变模板质粒的量，计算出需加入的Nuclease-Free Water的量，使总体积为49微升。适当混匀后，加入 1 ul Pfu DNA Polymerase，混匀。如果用的PCR仪没有热盖，在反应体系上加入一滴矿物油(mineral oil)以防止蒸发。
(2) 按照如下参数设置PCR仪：

步骤	循环数	温度	时间	说明
1	1	95℃	1分钟	最初变性
2	18	95℃	40秒	变性
		60℃	1分钟	退火
		68℃	1分钟/kb	延伸
3	1	72℃	10分钟	延伸、补全
4	1	4℃	长时间保持	暂时存放

说明：上面表格中1分钟/kb表示，如果待突变的质粒为6kb，那么68℃的延伸时间为6分钟。

5. Dpn I消化：
PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1微升Dpn I，混匀后37℃孵育1小时。37℃孵育可以在PCR仪上进行，也可以在水浴锅中进行。Dpn I消化完毕后可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。

6. 转化、挑克隆鉴定：
感受态细菌的转化效率必需至少在107以上，否则很难得到克隆。根据所使用的感受态细菌，加入尽量多的经过Dpn I消化后的突变产物用于转化。通常每100微升感受态细菌中可以加入5-10微升经过Dpn I消化后的突变产物。按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作，在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌，全部涂布到含有适当抗生素的平板上，培养过夜。通常会得到50个以下的克隆。如果发现克隆有上千个，那么肯定是有什么地方出了问题。
对于得到的克隆，可以先挑克隆小抽酶切鉴定。以确认得到的质粒的大小和质粒中插入片断的大小与预期结果是否相符。
取3-5个酶切鉴定正确的克隆去测序，以最终确认得到的克隆是否是预期的突变克隆。通常大约每2个克隆中会得到一个预期的突变克隆。但有时也可能会因为随机因素，会测序了3-5个克隆才得到一个预期的突变克隆。

除基因定点突变试剂盒优惠外，我公司正在打折促销以下产品：
ARB10474 人白介素12(IL-12/P70)ELISA代测服务 Human interleukin 12,IL-12/p70 ELISA KIT
BL1129 ELISA包被液(10x)
DP214 Universal DNA 纯化回收试剂盒
ARB12701 大鼠糖皮质激素受体β(GR-β)酶联免疫定量检测 Rat glucocorticoid receptor-β,gr-β ELISA KIT
BL0896 FITC标记羊抗人C3抗体
HC0346 BRAND 8道整支消毒移液器
CYB164026 羊抗马IgG(1：500～1000)-HRP
ARB13050 小鼠表皮调节素(EPR)血清中含量检测 Mouse epiregulin,epr ELISA KIT
脂磷壁酸 Hydroxynaphthol blue 56411-57-5
ARB13215 小鼠基质金属蛋白酶2/明胶酶A(MMP-2/GelAtInAse A)elisa测定使用说明书 Mouse matrix metalloproteinase 2/gelatinase a,mmp-2 ELISA KIT
ARB13091 小鼠细胞周期素D1(CyclIn-D1)ELISA代测服务 Mouse cyclin-d1 ELISA KIT
ARB12429 大鼠骨成型蛋白2(BMP-2)免费代测 Rat bone morphogenetic protein 2,bmp-2 ELISA KIT
F040322 绵羊IgG抗原 Sheep IgG
E0202 抗凝山羊血(无菌 袋装)
BL1041 苦味*(代"酸")
ARB11092 人垂草扁桃酸(VMA)Elisa分析 Human vanillylmandelic acid,vma ELISA KIT
ARB10600 人血小板碱性蛋白(PBP/CXCL7)血清中含量检测 Human platelet basic protein,pbp ELISA KIT
PY01-008 牛肉粉 250克
7114-03-6 Methyl Green 甲基绿
基因定点突变试剂盒优惠关键词：基因定点突变试剂盒,Site-directed Gene Mutagenesis Kit,YT027


·二甲基Histone H3(Lys4位点)抗体
编号：YT800
英文名称：anti-Di-Methyl-Histone H3(Lys4) antibody
规格：>20次
本抗体是用人工合成的histone H3氨基端的含有双甲基化Lys4的一段多肽经过适当修饰后免疫rabbit，然后用protein A和抗原多肽亲和柱经过两步纯化得到的高纯度单克隆抗体。本抗体如果用于常规的Western检测，至少可以检测20次。

本Di-Methyl-Histone H3(Lys4)抗体识别的是总Di-Methyl-Histone H3(Lys4)，可以检测内源性的Lys4双甲基化的histone
H3，未发现和Lys4非甲基化的histone H3、Lys4单甲基化的histone H3或Lys4三甲基化的histone H3有交叉反应。另外，本抗体与Lys9，Lys27，Lys36二甲基化或三甲基化的histone H3或Lys20二甲基化或三甲基化的histone H4都没有交叉反应。

组蛋白histone H2A，H2B，H3和H4各两个分子组成的八聚体和与该八聚体相结合的DNA构成了染色质的基本结构核小体(necliosome)。组蛋白的存在确保了基因组DNA可以被相对致密而有序地堆放在细胞核中。人一个细胞的基因组DNA完全拉成线性的总长度约为1.4米，但染色质的总长度仅为9厘米，而有丝分裂时染色体的总长度仅为0.12毫米。除了核心组蛋白(core histone)histone H2A，H2B，H3和H4外，还有一类linker histone H1和H5。Histone H1可以结合核小体和DNA在核小体中进出的位点，从而使DNA的位置被锁定，有利于在核小体基础上形成更高级的空间结构(参考下图)。组蛋白结合区域的DNA长度为147bp，核小体间的DNA长度大约为50bp。染色质空间结构的松散还是致密很大程度上决定了该区域基因转录水平的高低(参考下图)。



组蛋白是真核生物中呈强碱性的蛋白。组蛋白可以被乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化修饰。这些修饰会改变染色质的空间结构，从而在基因转录调控、染色体装配等过程中起重要作用。通常，histone H2B的Lys5，Lys12和Lys15会发生乙酰化修饰。Histone H3的Lys9，Lys14，Lys18和Lys23会发生乙酰化修饰。Histone H3的Ser10，Ser28和Thr11都会发生磷酸化修饰。Histone H3的这些磷酸化和有丝分裂或减数分裂过程中的染色质浓缩密切相关。Histone H3 Thr3的磷酸化在很多物种中都非常保守，可以被激酶haspin所催化。Histone H3的Thr3磷酸化发生在有丝分裂早期(prophase)，在有丝分裂的晚期(anaphase)则被去磷酸化。Histone H3和H4是甲基化修饰的主要组蛋白，哺乳动物细胞中histone H3和H4是高度甲基化的。组蛋白可以被单、双或三甲基化(mono-,di-,and tri-methylated)，和基因转录调控和染色体装配密切相关。Histone H3的Lys4二或三甲基化和很多基因的转录激活相关。Histone H3的Lys4二甲基化和三甲基化和基因的转录激活密切相关。尽管Lys4二甲基化的histone H3也在非转录激活区被检测到，Lys4二甲基化和三甲基化的histone H3在异染色质中是检测不到的。Histone H3的Lys9单甲基化和二甲基化和基因沉默和异染色质装配有关，而Lys9三甲基化的Histone H3在异染色质的pericentric domain区域富集。

Histone H3在其氨基端有一个较长的N terminal tail，在核小体的装配过程中起关键作用。Histone H3是各种histone中修饰程度最高的，在表观遗传(epigenetics)中起重要作用。Histone H3包括H3A1、H3A2和H3A3。人的hitone H3由近15个基因分别单独编码。

产品组份：
Di-Methyl-Histone H3(Lys4)抗体————20μl
Western一抗稀释液————20ml

抗体参数：
免疫原物种：人
免疫原：人工合成的人histone H3氨基端aa 1-20该段多肽
宿主：兔
用途：WB,IF,IHC,IP,ChIP
交叉反应性：人，小鼠，大鼠，猴
Di-Methyl-Histone H3分子量：～17kD
推荐稀释比例：WB(1:1000),IF(1:800),IHC(1:800),IP(1:25),ChIP(1:25)

注意事项：
1. 在Western实验后，请注意回收稀释的抗体。回收的抗体在进行Western实验时至少可以重复使用10次。稀释后的抗体，包括已经使用过的稀释抗体，4℃保存。
2. 回收后重复使用的抗体，使用方法同新鲜稀释的抗体。如果在重复使用过程中发现抗体出现轻微混浊现象，可以10000g离心1-3分钟，取上清用于后续检测。如果回收的抗体出现明显的絮状物或长霉长菌等情况，则可以考虑废弃该抗体。
3. 对于本抗体，Western检测时一抗要4℃缓慢摇动过夜，如果仅短时间与一抗孵育检测效果较差。

储存条件：-20℃，有效期一年。


基因定点突变试剂盒优惠关键词：基因定点突变试剂盒,Site-directed Gene Mutagenesis Kit,YT027


·尼氏染色液(Nissl染色液)
编号：YT167
英文名称：Nissl Staining Solution
规格：100ml
本染色液是神经生物学家广泛使用的一种Nissl染色液，用于石蜡或冰冻切片神经元细胞浆中的尼氏小体(Nissl body)染色。Nissl染色是以德国的精神病学家和神经病理学家Franz Nissl的名字命名的。Nissl染色液染色后呈蓝紫色，常用于显示脑或脊髓的基本神经结构。Nissl小体大而数量多，说明神经细胞合成蛋白质的功能较强；相反在神经细胞受到损伤时，Nissl小体的数量会减少甚至消失。本Nissl染色液染色的有效成分是Cresyl violet。Cresyl violet可以和RNA或DNA结合，可以染色粗面型内质网上的核糖体，也可以染色细胞核。染色后使细胞体呈现斑驳的(mottled)蓝紫色染色。一个包装的本染色液至少可以染色200个样品。

注意事项：
1. Nissl染色液的染色能力很强，并且染色后很难去除，请注意勿使染色液沾染皮肤和衣物等。
2. 需自备4%多聚甲醛、70%乙醇和95%乙醇。如果需要脱水、透明和封片处理，还需自备二甲苯，中性树胶或其它封片剂。如果样品是石蜡切片，需自备90%乙醇，无水乙醇以及二甲苯。
3. 第一次使用本试剂盒时建议先取1-2个样品做预实验。

储存条件：室温避光，有效期一年。

·Western及IP细胞裂解液
编号：YT038
英文名称：Cell lysis buffer for Western and IP
规格：100ml
本品是一种在非变性条件下裂解细胞的裂解液。本细胞裂解液裂解的细胞，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)。

Western及IP细胞裂解液的主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。

用Western及IP细胞裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用百奥莱博的BCA蛋白浓度测定试剂盒(YT036，YT037)测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。

储存条件：-20℃，有效期一年。

我公司生产供应销售的基因结构和功能正全品类优惠促销，十分期待您的咨询选购基因定点突变试剂盒优惠。