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Ni-NTA琼脂糖高速纯化树脂6FF(His标签) Ni-N

TA Agarose Resin 6FF
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  • ¥758
  • 翌圣生物(Yeasen)已认证
  • 上海翌圣
  • 20503ES10
  • 2026年03月14日
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    • 保质期

      有效期2年

    • 英文名

      HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF

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      大量

    • 供应商

      翌圣生物科技(上海)股份有限公司

    • 规格

      10mL

    产品信息
    产品名称 产品编号 规格 储存 价格(元)
    HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FFHis标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂 20503ES10 10 mL 4℃ 798.00
    HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FFHis标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂 20503ES50 50 mL 4℃ 3358.00
    HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FFHis标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂 20503ES60 100 mL 4℃ 5838.00
    HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FFHis标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂 20503ES60 1000 mL 4℃ 44686.00

    产品描述
    HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质,通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸(NTA)为配体,螯合镍离子(Ni2+)后,形成非常稳定的八面体结构,镍离子处于八面体的中心,这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻,更加稳定,可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。此外,因其基质的耐压性(可耐受最高0.3 MPa的压力),该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化,可在相对较高的流速下,实现对目的蛋白的纯化。

    产品性质
    基质(Matrix 高度交联的6%琼脂糖凝胶
    粒径(Bead size 45-165 µm
    载量(Capacity 40 mg 6×His-tagged protein/mL基质
    耐压(Tolerance Pressuremax 0.3 MPa3 bar
    储存缓冲液(Buffer 20%乙醇的1×PBS

    运输和保存方法
    冰袋运输。4℃保存。有效期2年。

    注意事项
    为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

    使用方法
    纯化流程
    1 缓冲液的准备
    缓冲液使用原理:低咪唑上样,高咪唑洗脱,或者高pH上样,低pH洗脱。Buffer 在使用前最好用0.22 µm0.45 µm滤膜过滤除菌。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表2。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表3
    2 样品准备
    2.1 细菌表达的蛋白(本说明以细菌表达的蛋白纯化为例)
    1)挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中,根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
    2)表达结束后,将培养液转至离心瓶,7000 rpm,离心15 min,收集菌体,然后加入1/10体积的裂解液(Lysis buffer)和PMSFPMSF在破碎前加入,其终浓度为1 mM),同时也可加入其他蛋白酶抑制剂,但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
    3)之后加入溶菌酶,使其工作浓度为1 mg/mL。【注】如果表达的宿主细胞内含pLysSpLysE,可以不加入溶菌酶。
    4)将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高,可考虑加入10 µg/mL RNase A5 µg/mL DNase I),混匀,置于冰上超声破碎细胞,至菌液基本保持澄清。
    5)收集上述澄清蛋白液至离心管中,10000 rpm4℃离心20-30 min。取上清,置于冰上备用或-20℃保存。
    2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
    将细胞培养液转移至离心瓶,5000 rpm离心10 min,收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等,即可直接上柱纯化;如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质,则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
    【注】对于大量体积的上清,需加入硫酸铵进行沉淀浓缩,之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
    2.3 包涵体蛋白纯化(以细菌为例)
    1)将培养液转移至离心瓶,7000 rpm,离心15 min,收集菌体去上清。
    2)按照菌体:裂解液=1:10w/v)的比例将菌体充分悬浮,混匀,冰浴超声破碎。
    3)将破碎液转移至离心管,10000 rpm4℃离心20-30 min,去上清。可重复步骤2)和3)一次。
    4)按照菌体:裂解液(含8M尿素)=1:10w/v)的比例将包涵体充分悬浮。
    5)变性条件下纯化His标签蛋白纯化。
    3 装柱
    1)用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头,确保柱底筛板上无气泡,关闭柱底出口,并在柱底部留出1-2 cm的去离子水。
    2)将树脂悬浮,小心地将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
    3)如果使用储液器,应立即在层析柱和储液器中加满水,将进样分配器放置于浆液表面,连接至泵上,避免在分配器或进样管中产生气泡。
    4)打开层析柱底部出口,开启泵,使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱,然后缓慢增加至最终流速,这样可避免液压对所形成柱床的冲击,也可以避免柱床形成的不均匀。如达不到推荐的压力或流速,可以用所用泵的最大流速,这样也可以达到一个较好的装填效果。当柱床高度稳定后,在最后的装柱流速下至少再上3倍柱体积的去离子水。标上柱床高度。【注】在随后的色谱程序中,不要超过最大装柱流速的75%
    5)关闭泵,关闭层析柱出口。
    6)如使用储液器,去除储液器,将分配器置于层析柱中。
    7)将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器,锁紧分配器接头。
    8)将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中,开始平衡。如需要可重新调整分配器。
    4 样品纯化
    装柱后,可用各种常规的中压色谱系统,以AKTA使用为例进行说明:
    1)将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞,连接至色谱系统中,打开下出口,将纯化柱连接到色谱系统中,注意旋紧。
    23-5倍柱体积去离子水冲洗纯化柱。
    3)至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。1ml规格预装柱推荐流速为1 mL/min5 mL预装柱推荐流速为5 mL/min
    4)利用泵或注射器上样,收集流出液,以便SDS-PAGE检测蛋白结合情况。【注】若样品粘度增加,即使上样体积很少也会导致层析柱很大反压;上样量不要超过柱子的结合能力;大量样品体积也可能造成很大的反压,使得进样器更难使用。
    5Wash Buffer 平衡柱子,直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。
    【注】在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
    6Elution Buffer一步法或梯度法进行洗脱。一步法洗脱中一般5倍柱体积洗脱液即可。梯度洗脱可以用一个小的梯度,例如20倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质。
    7)建议用更高浓度咪唑(如500 mM)彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用3倍柱体积的Lysis Buffer5倍柱体积的去离子水清洗树脂。5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂,最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中,置于4℃保存。
    5 SDS-PAGE检测
    将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测,判定其纯化效果。

    在位清洗
    当填料使用过程中发现反压过高(>0.5 Mpa)或者填料上面出现明显的污染时,需对其进行在位清洗(Cleaning-in-PlaceCIP)。在位清洗时,先把Ni2+脱掉,清洗结束后,将填料保存在20%乙醇中,后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物,如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
    1 去除强疏水结合的蛋白,脂蛋白和脂类
    使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积,接触时间为15-20 min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1 M醋酸_溶液,接触时间为1-2 h。去污剂处理后,需用70%的乙醇清洗5倍柱体积,彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。
    2 去除离子作用结合的蛋白
    使用1.5 M NaCl 溶液接触10-15 min,之后用去离子水清洗10倍柱体积。

    填料再生
    当填料使用过程中发现反压过高(>0.5 Mpa),填料上面出现明显的污染,或填料载量明显变低时,需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理,即填料再生。按照下面操作流程进行:
    1使用5倍柱体积去离子水清洗填料;
    2使用5倍柱体积100mM EDTApH 8.0)剥落镍离子;
    3使用10倍柱体积去离子水清洗填料
    4使用0.5M NaOH清洗5倍柱体积,停留10-15min
    5使用10倍柱体积去离子水清洗填料
    6使用3-5倍柱体积100mM NiSO4再生挂镍
    7)去离子水清洗10倍柱体积。
    填料再生后,可立即使用,也可保存在20%乙醇中,置于4℃备用。

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    附表1 HisSep Ni-NTA Agarose Resin试剂耐受情况
    试剂种类 浓度
    还原剂 5 mM DTE
    0.5-1 mM DTT
    20 mM β-mercaptoethanol
    5 mM TCEP
    10 mM reduced glutathione
    变性剂 8 M urea
    6 M Gua-HCl
    去污剂 2% TritonTM X-100nonionic
    2% TweenTM20nonionic
    2% NP-40nonionic
    2% Cholateanionic
    1% CHAPSzwitterionic
    其他类 500 mM imidazole
    20% ethanol
    50% glycerol
    100 mM Na2SO4
    1.5 M NaCl
    1 mM EDTA
    60 mM citrate
    缓冲液 50 mM sodium phosphatepH7.4
    100 mM Tris-HClpH7.4
    100 mM Tris-acetatepH7.4
    100 mM HEPESpH7.4
    100 mM MOPSpH7.4
    100 mM sodium acetatepH7.4
    缓冲液名称 配方 配制1L溶液所需各种试剂量
    Lysis BufferpH8.0 50 mM NaH2PO4
    300 mM NaCl
    10 mM imidazole
    NaOHpH8.00.22 µm0.45 µm过滤除菌
    NaH2PO4 ·2H2O 7.8 g
    NaCl 17.54 g
    Imidazole 0.68 g
    Wash BufferpH8.0 50 mM NaH2PO4
    300 mM NaCl
    20 mM imidazole
    NaOHpH8.00.22 µm0.45 µm过滤除菌
    NaH2PO4 ·2H2O 7.8 g
    NaCl 17.54 g
    Imidazole 1.36 g
    Elution BufferpH8.0 50 mM NaH2PO4
    300 mM NaCl
    250 mM imidazole
    NaOHpH8.00.22 µm0.45 µm过滤除菌
    NaH2PO4 ·2H2O 7.8 g
    NaCl 17.54 g
    Imidazole 17.0 g
    附表2 可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方



    附表3 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
    缓冲液名称 配方 配制1L溶液所需各种试剂量
    Lysis BufferpH8.0 8 M Urea
    100 mM NaH2PO4
    100 mM Tris·HCl
    盐酸溶液调pH8.00.22 µm0.45 µm过滤除菌
    Urea 480.5 g
    NaH2PO4 ·2H2O 15.6 g
    Tris 15.76 g
    Wash BufferpH6.3 8 M Urea
    100 mM NaH2PO4
    100 mM Tris·HCl
    盐酸溶液调pH6.30.22 µm0.45 µm过滤除菌
    Urea 480.5 g
    NaH2PO4 ·2H2O 15.6 g
    Tris 15.76 g
    Elution BufferpH4.5 8 M Urea
    100 mM NaH2PO4
    100 mM Tris·HCl
    盐酸溶液调pH4.50.22 µm0.45 µm过滤除菌
    Urea 480.5 g
    NaH2PO4 ·2H2O 15.6 g
    Tris 15.76 g

    附表4 问题及解决方案
    问题 可能原因 推荐解决方案
    柱子反压过高 填料被堵塞 裂解液中可能含微小的固体颗粒,建议上柱前使用滤膜(0.22 µm0.45 µm)过滤,或离心去除。
    样品中含高浓度的核酸,延长破碎时间直至粘度降低,或添加DNaseI (终浓度为5 µg/mL),Mg2+(终浓度1 mM),冰上孵育10-15 min
    样品太黏稠 有机试剂或蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高,降低操作流速。
    洗脱组分中无目的蛋白 蛋白可能是包涵体 可通过电泳检测裂解液,分析上清中是否有目的蛋白,包涵体蛋白需按照包涵体蛋白的纯化方式
    表达量太低 优化表达条件,使用包涵体纯化缓冲体系
    目的蛋白结合比较弱,在洗杂步骤中已被洗下来 提高Wash BufferpH值,或者降低咪唑浓度
    目的蛋白结合过强,不容易洗脱下来 降低Elution Buffer pH,或者增加Elution Buffer中的咪唑浓度
    使用10-100 mM EDTA溶液剥离镍离子,同时得到蛋白
    蛋白降解 菌体破碎时需添加一些蛋白酶抑制剂
    4℃下进行纯化操作
    洗脱组分不纯(含多种蛋白) 洗杂不彻底 增加Wash Buffer 体积
    样品中含有其他His标签蛋白 通过调节pH值或咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他纯化手段(如去离子交换,疏水等)进一步纯化洗脱组分。
    填料颜色变浅或变成白色 镍离子脱落或者剥离 按照填料再生的操作重新挂镍离子
    填料呈现褐色 缓冲液中含有DTT等还原剂 参考附3适当降低还原剂DTT的浓度,或改用巯基乙醇
    上样过程中蛋白发生沉淀 操作温度太低 室温下进行上样
    蛋白发生聚集 在样品和所有缓冲液中添加稳定剂,如0.1%Triton X-100Tween-20
    HB191216

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    [1] Li C, Zhan W, Yang Z, et al. Broad neutralization of SARS-CoV-2 variants by an inhalable bispecific single-domain antibody. Cell. 2022;185(8):1389-1401.e18. doi:10.1016/j.cell.2022.03.009(IF:41.584)
    [2] Li X, Liang Y, Lian C, et al. CST6 protein and peptides inhibit breast cancer bone metastasis by suppressing CTSB activity and osteoclastogenesis. Theranostics. 2021;11(20):9821-9832. Published 2021 Oct 11. doi:10.7150/thno.62187(IF:11.556)
    [3] Zhang Z, Chu Y, Li C, et al. Anti-PEG scFv corona ameliorates accelerated blood clearance phenomenon of PEGylated nanomedicines. J Control Release. 2021;330:493-501. doi:10.1016/j.jconrel.2020.12.047(IF:7.727)
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