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- 2025年07月15日
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依据发生死亡的细胞形态，生化和分子方面的变化的不同，可以将细胞死亡分为凋亡和坏死两种方式。细胞程序化死亡或称凋亡是真核细胞死亡的最常见的形式，它是细胞维持自稳状态而具有的一种生理性自杀机制，是发生于正常细胞的一种正常死亡。一般情况下,历经凋亡的细胞其细胞核与细胞浆会发生一些特征性变化，包括核膜快速皱缩及细胞核的崩解。这种胞核的塌陷与钙依赖的内源性核酸内切酶的活化而导致的染色体和 DNA 被裂解成寡核苷酸DNA 片段密切相关。凋亡是许多正常的生理过程所必需的，包括免疫系统的成熟和作用机制、组织器官和肢体的发生、神经系统的发生等过程。在许多病理条件下，凋亡机制的调节失衡起很重要的作用，包括出血、中风、心脏病、癌症、爱滋病、自身免疫缺损和中枢神经系统的退行性变等。在癌基因的研究方面，由于细胞凋亡可由抗癌药物、放射及高热等启动，并且肿瘤细胞具有由于一些癌基因表达即能启动凋亡的内在特性，因此细胞凋亡已引起人们的广泛重视。检测凋亡细胞的方法有数种。细胞凋亡过程中核酸内切酶的活化是关键的过程，导致核 DNA 被裂解成寡核苷酸大小的片段。因此，这个过程被用于检测凋亡，在琼脂糖凝胶电泳上出现典型的“DNA梯形带”。但是，这种方法既不能检测单个细胞水平的凋亡，又不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态等方面的信息。这一切可以由凋亡的原位酶标记方法来完成 DNA 聚合酶和末端脱氧核酸转移酶（TdT）用来标记DNA 链断端的核酸，应用TdT 进行的末端反应又称为ISEL 或TUNEL技术，它与ISNT 相比具有以下优点：灵敏度高、快速、优先标记发生凋亡的细胞，而不是坏死的细胞。
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文献和实验的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化(细胞凋亡)的最常用方法。(以TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒(增强型，绿色荧光)为例) TUNEL检测：使用20 U/ml Dnase处理Hela细胞10分钟。 二、TUNEL实验中关键步骤 1. 充分脱蜡和水化。脱蜡前可先将切片在 60ºC烤片 20 min，再使用二甲苯脱蜡2次，每次 5-10 min;而水化一般建议用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，便于后期试剂能充分、均匀的结合反应
用了许多方法检测小鼠的肝脏、脑部、睾丸等组织的细胞凋亡，其中 TUNEL 法做的最多，我购买的试剂盒主要是 roche、 promega 公司，结果大多数成功，偶尔也有失败，下面我把实验中的关键问题与大家共享一下，同时也希望能对初学者有所帮忙。 TUNEL 法的实验原理 基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让 rTDT 和生物标记的 dTUTP 进入细胞内，在 rTDT 的辅助下 dTUTP 与核断裂的 DNA 3』-OH 结合，再用 HRP 标记的链霉
Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸PS有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞胞膜结合，将Annexin V标记上荧光染料利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡。 由于凋亡晚期或坏死细胞膜完整性丧失，细胞核染色液可进入细胞内染色细胞核，搭配Annexin V使用可将处于不同凋亡时期的细胞区分开。 A．悬浮细胞： 按照实验方案进行凋亡诱导，300 g离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS洗涤细胞一次，轻轻重悬浮细胞并计数。 取1~5 ×
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