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酶联斑点(Elispot)实验
晶莱生物
实验服务
1、实验的准备工作
(1) 设备与耗材:
① 超净工作台;
② 5% CO2 37°C 细胞培养箱;
③ P20, P200, P1000 微量移液器;
④ P300 8通道微量移液器,P300 12通道微量移液器;
⑤ Biosys ELISPOT Reader
⑥ P20, P200, P1000 枪头;
⑦ 多道移液器吸槽;
⑧ 0.5mL,1.5mL EP管。
(2)溶液配制
① PBS: 用分析纯试剂,Millipore级别的纯水配制,高压灭菌。
② PBST: PBS加入0.05% Tween-20,注意无菌操作。储存于20-25°C,可存放一个月。
③ 70%乙醇:分析纯乙醇70mL,加入Millipore级别的纯水至100mL。
④ 30%乙醇:分析纯乙醇30mL,加入Millipore级别的纯水至100mL。
⑤ 包被抗体(coating antibody,Primary antibody):照U-Cytech说明书,加入双蒸水溶解。使用时,用PBS稀释50倍,每孔50μL。
⑥ 封闭液:用PBS将试剂盒中的封闭存储液(Blocking stock solution R)稀释10倍,每孔200μL。
⑦ 抗体稀释液:注意,只是用来稀释检测抗体和酶联亲和素。用PBS将试剂盒中的稀释存储液(Dilution buffer R)稀释10倍
⑧ 检测抗体(Biotinylated detector antibody,Secondary antibody):照U-Cytech说明书,加入双蒸水溶解。使用时,用抗体稀释液稀释100倍,每孔100μL。
⑨ 酶联亲和素(Streptavidin-HRP conjugate):照U-Cytech说明书,加入双蒸水溶解。使用时,用抗体稀释液稀释100倍,每孔100μL。
⑩ AEC显色液: 照U-Cytech说明书,用100mL 30%乙醇溶解底物缓冲液胶囊(Substrate buffer capsule),然后加入3.3mL AEC储存液(AEC stock solution),混合均匀后10mL每支分装,-20oC保存。使用时,解冻,每孔加入100μL。
⑪ PHA刺激物: 将储存液(2mg/ml, Murex)分装成20μL/EP管,-20°C长期冻存。使用时,加入980μL U-Cytech无血清培养基(或者1640基本培养基),成为工作液(40μg/mL,10倍终浓度),每孔加入10μL,终浓度4μg/mL。
⑫ U-Cytech无血清培养基:我们推荐无血清ELISPOT技术,它能排除血清的干扰,结果更加稳定可靠,背景也更好。如果没有,可以用含10% 血清的1640培养基代替。
2、ELISPOT标准操作程序
(1)第一天:ELISPOT包被程序
设计好试验,把每个孔要加入的内容做成卡片,到时候就会从容很多。
每孔加入15μL 70%的乙醇预湿30秒。
注意:
① 未润湿的PVDF膜是洁白的、不透明的,经过乙醇润湿之后,颜色变暗,变成半透明状,很容易观察二者的区别。
② 加乙醇的时候,枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方,注意枪头不到刺到PVDF膜。
③ 有时候,加入的乙醇挂在孔壁上,这时要盖上板盖,轻轻叩击,让乙醇顺势滑落。乙醇一旦接触到PVDF膜,就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜,使得膜的颜色和透明度发生变化。
④ 15μL是经过优化的体积,它能保证刚好完全浸润整块膜,而不会有剩余。如果加大使用量,乙醇溶液就会透过膜而积存在膜的背面,加深实验的背景。
⑤ 加入100μL去离子水洗涤三次,尽量减少乙醇的残留。
⑥ 按照试剂盒的使用说明,将包被抗体储存液稀释在PBS缓冲液中,每孔加入50μL,4°C包被过夜。
⑦ (次日)倾倒包被液,用PBS洗涤5次,最后一次,在灭菌的吸水纸上扣干。
⑧ 加入200μL试剂盒自带的稀释好的封闭液,37°C封闭1小时。
⑨ 倾倒封闭液,无须洗涤,直接可以进行细胞培养。(也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次,拍干,封口,4°C保存,可以在4°C保存数周。)
(2)第二天:铺细胞,加入刺激物,培养
① 整个实验设置一组正对照(PHA刺激),每一个细胞样品(同一个捐献者或者实验动物)要设一个负对照(不加刺激物),整块板还要加一个背景负对照(不含细胞,只加培养基和所有的检测试剂)。
② 填好实验卡片,用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。每一个细胞/刺激物的组合设置2-4个孔的重复(想要有统计学的意义,每个细胞/刺激物设4 个孔的重复)。
④ 取出封闭好的板,准备加入细胞。如果是以前做的封闭,可以加入200μL的U-Cytech无血清培养基,室温静置10分钟,倾倒,然后再重复一次。
⑤ 按照实验卡片的安排,加入不同浓度的细胞,100μL/well,细胞在孔中的分布要尽量均匀(要诀是加入细胞之后,不要再震动或者拍击 ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散,实际情况刚好相反)。正对照的细胞浓度为1x105/well,实验组的样品细胞浓度请自行调整。
⑥ 加入100μL的U-Cytech无血清培养基到背景负对照孔。
⑦ 正对照孔加入10μL PHA,终浓度4ug/mL,该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。
⑧ 加入实验者自己的刺激物(配制成10X终浓度,10μL/well)到实验孔。加完刺激物之后不要再拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让刺激物在孔中混合均匀,实际上,通过扩散,刺激物也会很快混合均匀。拍击板子会让细胞成圈的分布在孔的外周。
⑨ 当加完所有的样品之后,盖上板盖,放入二氧化碳培养箱,37°C培养18-24小时。注意在整个培养过程中避免移动、碰撞培养板。为了取得更好的结果,甚至开关培养箱的箱门也应该禁止。因为碰撞会造成细胞的移位,造成斑点的模糊、拖尾。
(3) 第三天:培养后操作
① 倾倒孔内的细胞及培养基。
② 低渗法将细胞裂解,每孔加入200μL冰冷的去离子水,将板置于冰上冰浴10分钟。
③ 每孔用200μLPBST洗涤10遍,洗涤最后一遍之后,将板倒扣在吸水纸上拍干。
④ 按照试剂盒说明的浓度,用抗体稀释液稀释检测抗体,每孔加入100μL生物素标记的检测抗体,37°C 1小时。
⑤ 每孔用200μL PBST洗涤5遍,洗涤最后一遍时,将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下,同时洗涤膜的正反两面,盖上保护层,将板倒扣在吸水纸上拍干。
注意:
① 洗涤膜的背面,我们摸索出的办法是,在一个浅托盘中盛上干净的PBST,将膜板的底面浸入,轻轻摇晃几次即可。注意,一定要将膜的背面和塑料保护层上的液体甩干之后,再合拢,盖上,不要伤害到膜。
② 按照试剂盒说明的浓度,用抗体稀释液稀释酶标的链霉亲和素,每孔加入100μL,37°C 1小时。
③ 每孔用200μL PBST洗涤5遍,洗涤最后一遍时,将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下,同时洗涤膜的正反两面,盖上保护层,将板倒扣在吸水纸上拍干。
④ 照试剂盒的说明,解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100μL的显色液,室温静置20-30分钟,注意避光。
⑤ 待斑点生长到适合的大小之后,以去离子水洗涤2遍,终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上,拍干细小的水珠,之后取下保护层,放在通风的地方,室温静置 10-30分钟,让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内,防止膜发脆、破裂。
⑥ 将ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自动读板仪内,调节好合适的参数,半点计数,并记录斑点的各种参数,作统计分析。
晶莱生物服务流程
晶莱生物实验服务项目
动物实验 | 细胞生物学 | 病理实验 |
消化系统模型 | 细胞培养 | 病理染色 |
胃酸分泌模型 | 普通细胞株 | HE染色 |
脓毒症模型 | 细胞缺氧培养 | 油红O染色 |
胃溃疡模型 | 细胞培养+支架 | 番红固绿染色 |
胰腺炎模型 | 干细胞培养 | Masson染色 |
肝纤维化模型 | 原代细胞分离/提取/培养 | 天狼猩红染色 |
DIO肥胖模型 | 细胞转染/病毒感染 | PAS糖原染色 |
胆结石模型 | Trans well共培养 | 阿利新蓝染色 |
结肠炎(UC)模型 | 细胞增殖 | 甲苯胺蓝染色 |
脂肪肝模型 | 细胞计数 | 尼氏染色 |
急性肝损伤模型 | 生长曲线测定 | LFB髓鞘染色 |
免疫、代谢系统疾病模型 | 存活曲线测定 | 普鲁士蓝染色 |
骨质疏松模型 | ccK-8增殖检测 | VG染色 |
糖尿病模型 | MTT增殖检测 | EVG染色 |
高尿酸血症模型 | CFSE检测增殖-流式检测 | VonKossa染色 |
呼吸系统模型 | BrDU检测-免疫荧光法 | 刚果红染色 |
肺纤维化模型 | 细胞凋亡 | 苏丹黑B染色 |
慢性肺阻塞模型 | Annexin V/PI流式检测细胞凋亡 | Trap染色 |
急性肺损伤模型 | WB检测凋亡相关蛋白 | 抗酸染色 |
哮喘模型 | 透射电镜观察凋亡小体 | 革兰氏染色 |
肺栓塞模型 | Tunel染色(POD法,DAB显色) | AB-PAS染色 |
支气管炎模型 | Tunel(荧光法,含试剂盒) | 亚甲基蓝染色 |
泌尿生殖系统模型 | DNA ladder法 | 苯胺蓝染色 |
慢性肾衰模型 | 细胞周期 | 荧光 DAPI染色 |
急性肾衰模型 | 细胞显微计数 | 普鲁士蓝染色 |
肾间质纤维化模型 | PI染色 | 间苯二酚碱性品红染色 |
肾结石模型 | BrdU渗入法 | 银染 |
肾炎模型 | 免疫荧光染色 | 黑色素染色 |
子宫内膜异位症模型 | PI流式检测细胞周期 | 镀银染色 |
心血管系统模型 | 细胞运动 | PASM 六胺银染色 |
冠心病模型 | Transwell检测细胞迁移 | VG染色 |
心肌梗死模型 | Transwell检测细胞侵袭 | 富尔根染色 |
心脏骤停模型 | 细胞划痕 | 亚甲基蓝染色 |
慢性心力衰竭模型 | 细胞克隆 | 碘-碘化钾染色 |
动脉粥样硬化模型 | 集落形成法/稀释铺板方法 | Goldner三色法染色 |
白血病模型 | 软琼脂克隆法 | PAS-萘酚磺S染色 |
高血压模型 | 毛细管克隆法 | 改良苯酚品红染色 |
神经系统模型 | 体外实验血管生成 | 网状纤维染色 |
脑卒中模型 | 磁珠分选细胞 | β-半乳糖苷酶染色 |
栓塞性脑梗死模型 | 流式分选细胞 | 镀银染色 |
脑出血模型 | 开机费 | movat五色染色 |
脑损伤模型 | 单色 | 维多利亚蓝染色 |
脊髓损伤模型 | 双色 | 免疫组化 |
帕金森模型 | CBA多细胞因子流式检测 | 免疫组化预式 |
老年痴呆模型 | 组织/血液细胞制备 | 免疫组化正式 |
应激模型 | 组织单细胞制备 | 免疫荧光(石蜡-单标) |
骨骼疾病模型 | 中性粒细胞提取 | 免疫荧光(石蜡-双标) |
骨折模型 | 其他样本细胞制备(如血液等) | 免疫荧光(石蜡-三标) |
骨缺损模型 | 外周血PBMC分离 | 免疫荧光(冰冻-单标) |
风湿免疫性关节炎模型 | 线粒体组学 | 免疫荧光(冰冻-双标) |
骨关节炎模型 | 线粒体膜电位检测-流式法 | 制片前处理 |
五官疾病模型 | 线粒体膜电位检测-免疫荧光法 | 石蜡组织包埋 |
眼科疾病模型 | 线粒体ROS生物含量检测--流式 | 特殊包埋(细胞、材料、眼球等) |
鼻腔疾病模型 | 线粒体ROS生物含量检测--免疫荧光 | 软化(肝硬化、皮肤结痂、植物等) |
皮肤疾病模型 | 线粒体通透性转换孔(mPTP) | 骨组织脱钙(小) |
皮肤损伤模型 | 溶酶体免疫荧光法 | 骨组织脱钙(大) |
肿瘤疾病模型 | 线粒体+溶酶体共定位 | 骨组织EDTA脱钙(小) |
原位瘤模型 | 内质网 | 骨组织EDTA脱钙(大) |
转移瘤模型 | 线粒体钙瞬时变化检测-流式 | 石蜡白片 |
皮下植瘤模型 | ATP检测 | 细胞爬片 |
ADP检测 | ||
AMP检测 | ||
流式 | DNA/RNA半定量检测 | 基因编辑工具 |
组织细胞悬液处理 | pcr检测mRNA | 合成(3保1)片段/质粒/引物合成 |
细胞处理 | microRNA检测 | 质粒载体构建 |
血液标本处理 | LncRNA表达量的检测 | 过表达腺病毒载体构建包装 |
细胞刺激培养 | CirRNA表达量的检测 | shRNA腺病毒载体构建包装 |
单色检测 | 凝胶电泳 | 过表达慢病毒载体构建包装 |
双色检测 | 基因合成 | shRNA慢病毒载体构建包装 |
Annexin V/PI凋亡 | <300 | 过表达腺相关病毒载体构建包装 |
细胞周期 | 300-1,500 | shRNA腺病毒载体构建包装 |
1500 - 5000 | 稳转细胞株 | |
>5000 | ||
特殊序列 | ||
ELISA | WB | qPCR |
组织匀浆处理 | 蛋白提取及定量一 | RNA抽提 |
ELISA(不含试剂盒)48T/kit | WB检测一(10孔膜/指标) | mRNA引物设计及合成 |
ELISA(不含试剂盒)96T/kit | 灰度值分析及作图一(10孔膜/指标) | miRNA引物设计及合成 |
ELISA(含国产试剂盒)48T/kit | 蛋白提取及定量二 | LncRNA引物设计及合成 |
ELISA(含国产试剂盒)96T/kit | WB检测二(10孔膜/指标) | CircRNA引物设计及合成 |
灰度值分析及作图二(10孔膜/指标) | mRNA RT-qPCR | |
miRNA RT-qPCR | ||
LncRNA RT-qPCR | ||
CircRNA RT-qPCR |
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