酶联斑点（Elispot）实验服务

酶联斑点（Elispot）技术概述 ：
酶联斑点（Elispot）全名为酶联免疫斑点检测，英文：Enzyme-linked Immunospot Assay。它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。

1、实验的准备工作

(1) 设备与耗材：

① 超净工作台;

② 5% CO2 37°C 细胞培养箱;

③ P20， P200， P1000 微量移液器;

④ P300 8通道微量移液器，P300 12通道微量移液器;

⑤ Biosys ELISPOT Reader

⑥ P20， P200， P1000 枪头;

⑦ 多道移液器吸槽;

⑧ 0.5mL，1.5mL EP管。

(2)溶液配制

① PBS： 用分析纯试剂，Millipore级别的纯水配制，高压灭菌。

② PBST： PBS加入0.05% Tween-20，注意无菌操作。储存于20-25°C，可存放一个月。

③ 70%乙醇：分析纯乙醇70mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。

④ 30%乙醇：分析纯乙醇30mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。

⑤ 包被抗体(coating antibody，Primary antibody)：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用PBS稀释50倍，每孔50μL。

⑥ 封闭液：用PBS将试剂盒中的封闭存储液(Blocking stock solution R)稀释10倍，每孔200μL。

⑦ 抗体稀释液：注意，只是用来稀释检测抗体和酶联亲和素。用PBS将试剂盒中的稀释存储液(Dilution buffer R)稀释10倍

⑧ 检测抗体(Biotinylated detector antibody，Secondary antibody)：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。

⑨ 酶联亲和素(Streptavidin-HRP conjugate)：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。

⑩ AEC显色液： 照U-Cytech说明书，用100mL 30%乙醇溶解底物缓冲液胶囊(Substrate buffer capsule)，然后加入3.3mL AEC储存液(AEC stock solution)，混合均匀后10mL每支分装，-20oC保存。使用时，解冻，每孔加入100μL。

⑪ PHA刺激物： 将储存液(2mg/ml， Murex)分装成20μL/EP管，-20°C长期冻存。使用时，加入980μL U-Cytech无血清培养基(或者1640基本培养基)，成为工作液(40μg/mL，10倍终浓度)，每孔加入10μL，终浓度4μg/mL。

⑫ U-Cytech无血清培养基：我们推荐无血清ELISPOT技术，它能排除血清的干扰，结果更加稳定可靠，背景也更好。如果没有，可以用含10% 血清的1640培养基代替。

2、ELISPOT标准操作程序

(1)第一天：ELISPOT包被程序

设计好试验，把每个孔要加入的内容做成卡片，到时候就会从容很多。

每孔加入15μL 70%的乙醇预湿30秒。

注意：

① 未润湿的PVDF膜是洁白的、不透明的，经过乙醇润湿之后，颜色变暗，变成半透明状，很容易观察二者的区别。

② 加乙醇的时候，枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方，注意枪头不到刺到PVDF膜。

③ 有时候，加入的乙醇挂在孔壁上，这时要盖上板盖，轻轻叩击，让乙醇顺势滑落。乙醇一旦接触到PVDF膜，就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜，使得膜的颜色和透明度发生变化。

④ 15μL是经过优化的体积，它能保证刚好完全浸润整块膜，而不会有剩余。如果加大使用量，乙醇溶液就会透过膜而积存在膜的背面，加深实验的背景。

⑤ 加入100μL去离子水洗涤三次，尽量减少乙醇的残留。

⑥ 按照试剂盒的使用说明，将包被抗体储存液稀释在PBS缓冲液中，每孔加入50μL，4°C包被过夜。

⑦ (次日)倾倒包被液，用PBS洗涤5次，最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。

⑧ 加入200μL试剂盒自带的稀释好的封闭液，37°C封闭1小时。

⑨ 倾倒封闭液，无须洗涤，直接可以进行细胞培养。(也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次，拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存数周。)

(2)第二天：铺细胞，加入刺激物，培养

① 整个实验设置一组正对照(PHA刺激)，每一个细胞样品(同一个捐献者或者实验动物)要设一个负对照(不加刺激物)，整块板还要加一个背景负对照(不含细胞，只加培养基和所有的检测试剂)。

② 填好实验卡片，用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。每一个细胞/刺激物的组合设置2-4个孔的重复(想要有统计学的意义，每个细胞/刺激物设4 个孔的重复)。

④ 取出封闭好的板，准备加入细胞。如果是以前做的封闭，可以加入200μL的U-Cytech无血清培养基，室温静置10分钟，倾倒，然后再重复一次。

⑤ 按照实验卡片的安排，加入不同浓度的细胞，100μL/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀(要诀是加入细胞之后，不要再震动或者拍击 ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散，实际情况刚好相反)。正对照的细胞浓度为1x105/well，实验组的样品细胞浓度请自行调整。

⑥ 加入100μL的U-Cytech无血清培养基到背景负对照孔。

⑦ 正对照孔加入10μL PHA，终浓度4ug/mL，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。

⑧ 加入实验者自己的刺激物(配制成10X终浓度，10μL/well)到实验孔。加完刺激物之后不要再拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让刺激物在孔中混合均匀，实际上，通过扩散，刺激物也会很快混合均匀。拍击板子会让细胞成圈的分布在孔的外周。

⑨ 当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37°C培养18-24小时。注意在整个培养过程中避免移动、碰撞培养板。为了取得更好的结果，甚至开关培养箱的箱门也应该禁止。因为碰撞会造成细胞的移位，造成斑点的模糊、拖尾。

(3) 第三天：培养后操作

① 倾倒孔内的细胞及培养基。

② 低渗法将细胞裂解，每孔加入200μL冰冷的去离子水，将板置于冰上冰浴10分钟。

③ 每孔用200μLPBST洗涤10遍，洗涤最后一遍之后，将板倒扣在吸水纸上拍干。

④ 按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释检测抗体，每孔加入100μL生物素标记的检测抗体，37°C 1小时。

⑤ 每孔用200μL PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。

注意：

① 洗涤膜的背面，我们摸索出的办法是，在一个浅托盘中盛上干净的PBST，将膜板的底面浸入，轻轻摇晃几次即可。注意，一定要将膜的背面和塑料保护层上的液体甩干之后，再合拢，盖上，不要伤害到膜。

② 按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释酶标的链霉亲和素，每孔加入100μL，37°C 1小时。

③ 每孔用200μL PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。

④ 照试剂盒的说明，解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100μL的显色液，室温静置20-30分钟，注意避光。

⑤ 待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置 10-30分钟，让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂。

⑥ 将ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自动读板仪内，调节好合适的参数，半点计数，并记录斑点的各种参数，作统计分析。

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