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pET-NLS-Cas9-6×His
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100
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kelei-bio
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20μl
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文献和实验到 Cas9(D10A) 的 N 末端，并将核定位信号 (NLS) 肽添加到 Cas9(D10A) 的 C 末端，构建了 APOBEC1-XTEN-Cas9(D10A) 植物基因组单碱基编辑系统。利用该系统对水稻 NRT1.1B 和 SLR1 进行编辑，结果表明该系统能在靶位点产生预期的 C→T(G→A) 碱基替换，NRT1.1B 和 SLR1 在靶位点产生预期突变的效率分别为 2.7% 和 13.3%。夏兰琴和赵云德合作团队也利用 APOBEC1、Cas9 变体 (nCas9-D10A) 和 UGI
编码区的基因片段，其由5'末端的stat密码子（ATG）和3'末端的终止密码子（TAA，TAG或TGA）结合。然后将目的基因片段插入pMD18-T载体中以构建重组质粒，通过DNA测序鉴定。用指定的酶消化重组pMD18-T质粒，并通过以下方案将检索到的目的DNA片段亚克隆到pET-32α（+）载体中以产生重组表达载体。将约129bp的TBO基因片段插入pET-32α（+）载体（5900bp）用相同的限制酶在37℃消化pET-32α（+）载体和重组pMD18-T载体1小时，然后通过在65℃温育10分钟
的单一峰，分选两端的做法不成立。 --- 三、配套能力：测序与分析 测序深度 一般要求每个 gRNA 至少有 200–500 条 reads。以 7 万条 gRNA 计，每个样本需要 1500 万–3500 万条有效 reads。按样本数（通常每组 3 个重复 × 多个时间点/分组）计算总测序量。 关键质控节点 质粒/病毒文库本身的分布：建库前先测序，确认 gRNA 分布均一（基尼系数、缺失率）。分布不均的文库会让后续分析产生系统性偏差； 第 0 天（T0）样本：感染后、施加压力前必须取样测序
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