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- 2025年07月15日
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pX459
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100
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kelei-bio
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20μl
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柯雷生物拥有数万种质粒，菌种，基因，细胞株，试剂盒等科研资源，还提供基因合成，质粒改造，载体构建和蛋白表达等精品实验服务
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文献和实验手把手教你利用 CRISPR-Cas9 系统精准敲除靶标基因
2 Cas9 - 2 hitKO 系统三、Cas9 - 2 hitKO 系统中涉及到的载体为了达到高效的敲除效率，我们在同一个载体重引入 cas9 酶和两个向导性 RNA。整个系统包括 3 个载体： PX458M ，PX459M 和 EZ-GuideXH。PX458M ，PX459M 除了含有 Cas9 和一个向导性 RNA 插入位点，还引入第二个向导性 RNA 插入位点。EZ-GuideXH 是为插入第二个向导性 RNA 的辅助性载体。PX458M 带有 EGFP 荧光标记; PX459M 带有
CRISPR/Cas9 是一种强大的基因组编辑工具，今天我们介绍 CRISPR/Cas9 系统操作。以下操作说明是基于作者冰糖个人实验室操作，仅供参考。 质粒介绍我们使用的是 Feng Zhang 实验室的系统的 pX330 质粒，如下图所示： 酶切系统 37 ℃, 3 hr；Run 1% gel，回收。Elute 到 50 mL H2O。我们利用 BbsI 消化载体形成粘末端，以利于下游 oligo 退火产物的连接；酶切时请充分，且绝对不能加 CIP 处理
和 sgRNA 用慢病毒或者质粒进行转染、或者直接注射 DNA/RNA，甚至直接转染蛋白复合体等。 Cas9 蛋白就能靶向感兴趣的基因座，并产生双链切口 (DSBs)，然后切口会被细胞本身的修复机制所修复。 非同源末端连接修复 (NHEJ) 就是其中一种，而 NHEJ 是一种易错修复途径，通常会引起少量插入或者缺失突变，开放阅读框 (ORF) 就会被破坏，这个基因就被灭活了。 同源重组修复 (HDR)，通过在 Cas9-sgRNA 组分中加入一个供体 DNA，供体 DNA
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