Lipofectamine 2000转染试剂

描述

Lipofectamine® 2000转染试剂是一种多用途转染试剂，可在各种贴壁和悬浮细胞系中提供高效转染。研究人员可使用Lipofectamine® 2000试剂进行基于siRNA和shRNA的基因敲除实验及基因表达研究。Lipofectamine® 2000是Life Technologies提供的用于siRNA和质粒DNA共转染的最佳试剂。

采用Lipofectamine® 2000试剂，您可以实现：

• 在各种细胞系中具有卓越的转染效率和高重组蛋白表达水平 (表1)

• 出众的siRNA和质粒DNA共转染性能

• 在血清存在时亦具有可靠的转染效率 – 转染后无需更换培养基

• 适用于高通量应用的可靠性能

• 建立稳定细胞系的最佳选择

适用于基因表达和基因沉默的高性能转染试剂

Lipofectamine® 2000试剂适合所有常见细胞系及许多难以转染的细胞系，可用于含有或不含血清的培养基。在基因沉默应用中，Lipofectamine® 2000试剂的高效转染提供了很高的基因敲除水平，足以获得令人信服的结果。Lipofectamine® 2000试剂可实现siRNA和质粒DNA的高效转染，它是共转染的首选试剂。Lipofectamine® 2000试剂使用方便 – 只需将其与核酸混合，加入细胞培养物即可。

适合高通量操作

Lipofectamine® 2000试剂使用简单、快速且具有很高的转染效率，适用于瞬时蛋白表达或高通量RNAi转染。在上述应用中，可轻松建立自动化或机器人系统转染条件。如需了解有关Lipofectamine® 2000的实验方案、文献引证及其它产品信息，可登录细胞系数据库。

仅供研究使用。不得用于人或动物的治疗或诊断。

一、invitrogen的王牌：Lipofectamine 2000

Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。已知可为517种细胞(见下面连接地址)提供高转染效率(表达转基因细胞的百分数)和活性(细胞抽提物中转入基因的酶产物活性)。

特点 两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：

(1)DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕

(2)转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基

操作流程 事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24-96小时检测结果。下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。

转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基(如OPTI-MEMⅠ培养基)稀释0.8μg-1.0μg DNA。

对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟(在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。) 注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。

混合稀释的DNA(第2步)和稀释的Lipofectamine 2000(第3步)。在室温保温20分钟。

注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。

直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml无血清培养基。

在37℃，5%的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。

在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

对于96孔板培养，不再需要提前一天进行细胞铺板，而可以直接在平板中制备复合物，然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了，这样进一步减少了转染时间。这种改进步骤已经过293-H，293-F，COS-7L和CHO细胞的试验，同传统方法相比活性稍低。快捷的步骤和蛋白表达细胞系的高效转染使得Lipofectamine 2000非常适用于96孔板的高通量转染，比如cDNA文库的筛选和蛋白瞬时表达。

适用细胞株范围 不同的转染试剂所适用的细胞株范围各不相同。一个实验室常常会用到不止一种细胞株，甚至是比较特殊的细胞株。一个转染试剂所适用的细胞株越多，当然越受用户的欢迎。根据Invotrogen网站的资料，Lipofectamine 2000已经证实可用于高达517种细胞株，覆盖了相当广的范围。要看看Lipofectamine 2000是否适用于你现有的细胞株，可以访问以下Invitrogen网址(http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageID=9559&fuseaction=CellLines.dsp_searchRange)

适用的核酸类型和DNA大小 有的转染试剂是为siRNA转染而设计的，有的则是为DNA转染设计。Lipofectamine 2000可以适用于包括DNA，siRNA, dsRNA, 荧光标记的Oligo, RNA等在内的核酸转染，这使得Lipofectamine 2000适用范围非常广泛，无论是基因表达分析的DNA转染，或者是RNAi，Lipofectamine 2000都能胜任，这样你就不需要为不同目的购买不同试剂了。值得注意的是，最常用的DNA转染中有一个DNA大小的问题，太大的质粒不那么好转。我们暂时还没有找到Lipofectamine 2000相应的资料。

用量和价格 好东西往往不便宜。可是在实验室中，价格往往是最具有杀伤力的。Lipofectamine 2000用的剂量大吗?价格如何?根据说明书，24孔板转染每次用2ul左右，1.5ml Lipofectamine 2000大约可做750次24孔板转染，或者大约150次6孔板转染，而1.5ml Lipofectamine 2000当前市场价格4667元，0.75ml价格是2798元(可以磨到多少折扣就要看你的侃价功力了)。平均下来，再算上折扣，Lipofectamine 2000性价比还是挺高的。

注意事项 Lipofectamine 2000要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响。Lipofectamine 2000可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基，使得操作方便了许多，但是要注意制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。复合物形成后是可以加入血清。这里要特别注意检测所用的无血清培养基是否能和Lipofectamine 2000匹配，比如已知CD293, SFM II, VP-SFM就不行。此外还应该留意，如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者时细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密较低的转染试剂，不适合用 Lipofectamine 2000。

对于大多数阳离子脂质体试剂，应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA和转染试剂的比例，通常推荐是1:2或者1:3，优化可以从0.5-5之间慢慢试。使用小剂量确定的优化条件可以用于进行大剂量的转染，只要根据培养板表面比例线性增加铺板细胞的数目、阳离子脂质体试剂和DNA量就可以了。

还有转染的时候培养基中不能添加抗生素。抗生素，比如青霉素和链霉素，一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前就不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。

阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。 当然还有要注意质粒的质量，质粒的内毒素是转染的大敌，Invitrogen自然是大力推荐自家的质粒纯化产品啦，这个嘛，看看生物通前面的质粒纯化专题有特别介绍就好啦。

二、今年的新产品：Lipofectamine 2000 CD 和 Optifect

作为一个新产品，Lipofectamine 2000 CD当然应该有区别于原来的Lipofectamine 2000。这个1ml就要卖到5000多块的新产品好在哪里?主要是由于不采用动物来源的材料，可以满足某些特殊要求，比如要求不含动物来源材料等。其他优缺点和Lipofectamine 2000差不多。以24孔板计算，一次2ul,1ml足够500次转染，但价格不便宜，要5000多元。

Optifect 主要是为在较低铺板密度条件下转染而设计的，比如细胞增埴相关基因和细胞周期相关基因的表达和研究往往要求较长的表达周期，细胞表面蛋白的表达和研究、还有部分高通量筛选等等也要求在较低铺板密度条件下转染，由于Lipofectamine 2000要求转染时90-95%汇片而不太适合，Optifect就是一个选择。Optifect最佳的铺板密度是30%-70%，其他的操作和注意事项也和Lipofectamine 2000相近。同样可以直接加入细胞培养物中，转染前后都不需要更换血清，同样不要加抗生素，等等。1ml价格是3616，用量相对高一些，24孔板一次需要3-4ul，6孔板就要用到15-24ul/次，每次算下来就比前面的贵了。

三、闻道有先后，术业有专攻，Invitrogen的其他几个当家花旦

LIPOFECTAMINE PLUS：是老版LIPOFECTAMINE的改良版。加入PLUS试剂后会导致在广泛条件下的高活性，不需要进行细节优化就可以进行高活性转染了。实验步骤同样很简单，细胞铺板密度以转染当天汇合度至70%到90%为宜。

DMRIE-C 转染悬浮细胞效率最高，如Jurkat细胞以及其他淋巴细胞来源的细胞系。也可以用来转染摇瓶中使用CD CHO培养基培养的悬浮CHO细胞，易于放大。另外建议用DMRIE-C将RNA转染入贴壁细胞。它比使用LIPOFECTIN转染RNA至BHK-21细胞的表达水平高。