AAV在肌肉组织中的应用

目前，对于肌肉组织中使用的病毒载体通常会选用腺相关病毒，因为腺相关病毒不仅能够高效特异地靶向肌肉组织，且能在肌肉组织中表达持久。腺病毒使用时容易引起较强的免疫反应，并且很容易被清除，表达时间比较短暂，较少被应用于肌肉组织的靶向表达。尽管慢病毒感染表达范围广泛，对培养的肌肉细胞均能高效表达，但是对肌肉组织的感染表达非常有限。目前靶向肌肉的AAV载体血清型主要为AAV1，AAV6和AAV9。其中，AAV9的表达效率最高，并且更容易在肌肉中高表达。
AAV在肌肉中的注射及表达
肌肉组织的AAV载体递送，一般分为系统注射和肌肉内注射。系统注射如前面所述，表达较均匀，但是大部分病毒会被其他脏器组织吸收，导致靶向肌肉的病毒较少。肌肉内注射是一种定点注射，可以在注射点附近高效表达，但缺点是病毒扩散十分有限，因此往往需要多点注射，一般每个点在5-10ul。
通常CMV、CAG等启动子在肌肉组织中具有较高的表达效率，如果要实现肌肉组织的特异性表达，可以采用定点的递送方式达到，很少情况下要求使用组织特异性启动子。

AAV在肌肉组织中的应用
一、通过CRISPR/Cas9技术，改善杜氏肌肉营养不良
杜氏肌肉营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种由Dystrophin基因突变引起的X染色体隐性遗传病，在男性中的发病率大约1/5000，会造成病人肌肉退化和过早死亡。该病中Dystrophin基因发生突变，影响了Dystrophin蛋白表达情况。研发人员试图通过基因治疗恢复肌肉中Dystrophin蛋白的表达。然而，Dystrophin蛋白很大，由3685个氨基酸组成，编码基因超过10kb，已经超出一般表达载体的运载范围。这也正是该病治疗的难点所在。
有研究人员尝试使用截断的miniDystrophin蛋白缓解症状，原因是另外一种相对温和的疾病BMD（Becker muscular dystrophy）也是由Dystrophin基因读码框内的缺失造成的，Dystrophin蛋白中间存在一段截断突变，但是症状要缓和很多。因此这些提示我们可以使用exon-excision/exon skipping策略来删除移码突变的外显子，得到回复部分功能的截短突变的Dystrophin蛋白，以缓解症状（图1）。
在基于AAV的基因治疗中，装载基因大小在2.5kb左右。本实验中，研究人员使用CMV启动子驱动mini Dystrophin基因表达，并包装进AAV2/9载体中。将AAV经过静脉注射入出生4天的动物中，16周后检测目的基因在各个区域的表达情况，结果发现15%~100%肌纤维中均检测到mini Dystrophin蛋白表达。并且，分析该疾病动物模型的病理表型，发现也得到了改善。然而动物的几处下肢肌肉中出现明显免疫反应，可能是因为注射了超高剂量AAV病毒，过高表达了外源基因等，从而刺激了较强的免疫反应（图2）。
2016年1月，《Science》杂志在线发表了3个实验室利用CRISPR/Cas9技术通过exon-excision策略治疗DMD的研究成果。研究人员设计两个sgRNA同时靶向移码突变的外显子两侧的内含子序列，达到删除目标外显子的目的。研究人员把CRISPR/Cas9系统元件装载在AAV9载体上，递送到心肌和骨骼肌中表达，并成功检测到功能性的Dystrophin蛋白表达，部分恢复肌肉的功能（图3、图4）。
二、通过抑制肌肉抑制素，实现长效增加骨骼肌质量
肌肉抑制素（Myostatin）是TGF-β超家族的成员，是调节骨骼肌质量的重要因子。肌肉抑制素通过调节发育阶段肌纤维的数量和出生后肌肉组织的生长来负调节肌肉组织。如果通过抗体中和或RNAi等方法抑制肌肉抑制素，则能够有效刺激肌肉组织生长，加强肌肉组织强度，肌肉质量增加能显著改善一些神经-肌肉综合征的病理表现。因此，抑制肌肉抑制素是一种非常有前景的针对肌肉缺陷的治疗策略。
卵泡抑素（Follistatin，FS）是一种能够结合肌肉抑制素并抑制其功能的蛋白因子。过表达卵泡抑素可以增加肌肉的生长，相反缺乏卵泡抑素则导致新生动物肌肉偏少。将卵泡抑素基因包装入AAV1载体中，通过肌肉注射进正常小鼠，显著增加肌肉质量和力量；作用于DMD小鼠模型，即便在6.5月龄小鼠中也能逆转肌肉组织的病理表型，并显著增强肌肉的力量（图5）。
三、表达脂蛋白酯酶，缓解脂蛋白酯酶缺陷病
脂蛋白酯酶缺陷是一种常染色体隐性遗传病，由编码脂蛋白酯酶（Lipoprotein lipase，LPL）的基因突变引起，导致血液中脂质甘油三酯不能被水解并被肌肉组织有效吸收利用，患者血液中积累大量的甘油三酯，并引发其他多种代谢综合征，发病率大约百万分之一。全球第一例批准的临床药物Alipogene tiparvovec就是基于AAV1递送到肌肉组织表达的LPL，成功降低动物及病人血液中甘油三酯水平，提高肌肉组织对甘油三酯的吸收利用，并降低其他并发症的发生。
四、修改衣壳蛋白获得腺相关病毒新的感染趋向性
有研究人员通过融合AAV1和AAV9衣壳蛋白，获得一些随机突变的衣壳蛋白表达文库，然后通过小鼠活体实验筛选出一株新的衣壳蛋白AAVM41，能够高效感染骨骼肌，但是相对于AAV9，AAVM41对肝脏的感染效率显著降低（图6、图7）。 根据上述文章的结果，我们可以借鉴这种思路进行新型AAV血清型改造，获取我们需要的新型衣壳蛋白，实现特定的组织感染表达趋向性。然而，从本文可以看出，新型血清型AAVM41感染表达效果相比AAV9是偏弱的，但是特异性系数显著增加。
对某一器官组织如何选择最佳AAV血清型进行感染，不同文章中得出的结论往往不一致。原因大致包括以下几点：1）各种AAV血清型在不同实验室存在不同程度的改造或者突变；2）病毒注射对象不同，感染效果也有差别；3）实验条件不同，如启动子、小鼠年龄状态、目的基因大小等；4）注射方式不同，也会有明显的差异。建议如果实验室条件允许的话，可以自己先测试一下，如果条件不允许，参照同等包装体系下的实验结果。