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泽叶生物
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g/mg
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文献和实验一、实验目的 1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理; 2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。 二、实验原理 有机溶剂分级沉淀是分离蛋白质的常用方法之一。有机溶剂能使许多溶于水的酌生物大分子发生沉淀,其主要作用是降低水溶液的介电常数。例如20℃时水的介电常数为80,82%的乙醇溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低意味着溶质分子间异性电荷库仑引力增加,从而使溶质的溶解度降低
高。如果有相同的抗原决定簇时,则会有交叉反应。方法成熟,使用广泛的还是经典的组织化学方法。下面以碱性磷酸酶的显示方法来学习经典酶组织化学的理论及操作。经典酶组织化学不是显示酶本身,常采用的方法是:在一定条件下,使细胞中的酶作用于酶的底物,使其产物在原地进行捕捉、沉淀转化为有色产物。碱性磷酸酶(AKP)的显示方法最早由Gomeri(1939)提出,现在这种方法称为Gomeri法。碱性磷酸酶是指磷酸单酯酶Ⅰ,它能在pH8.6~10.0的最适条件下分解磷酸单酯,对于与磷酸相接的醇基没有特异性,Gomeri法
磷酸钠,α-萘酚磷酸钠)分解,产生的磷酸离子被孵育液中的钙离子捕获生成磷酸钙沉淀。因磷酸钙不能显色,需加入硝酸钴,用钴离子置换钙离子,形成磷酸钴沉淀后用硫化铵处理,形成棕黑色硫化钴颗粒沉淀,从而显示酶活性部位,硫化钻沉淀的多少与碱性磷酸酶含量成正比,其反应通式 碱性磷酸酶钙-钴法反应原理1)孵育液配制2%氯化钙 20ml2%巴比妥钠 10ml3%β甘油磷酸钠 10ml5%硫酸镁 5ml蒸馏水 5ml孵育液最终pH 9.4,置于冰箱
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