AU565 [AU-565]说明书

AU565 [AU-565]细胞复苏操作步骤：
实验前准备：
1.将水浴锅预热至37℃。
2.用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等。
迅速解冻：
1. 迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，时间控制在1分钟左右。
离心去除冻存液：
1． 融解好的细胞迅速放进离心机中，2000r/min 或者600g离心2min。
2． 吸弃上清液。
3． 用4-5ml完全培养基重悬细胞，吹打制成单细胞悬液，细胞浓度以5×105/ml为宜。
4． 将复苏好的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内，8-24小时后换液继续培养培养，换液的时间由细胞生长情况而定。
一、传代细胞的传代培养
（1）AU565 [AU-565]细胞吸除或倒掉原瓶中的旧培养基（以25mL培养瓶为例）。
（2）每瓶加入2mL,无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉。
（3）每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液），轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，再继续作用2~3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化。
（4）加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤。
（5）AU565 [AU-565]细胞用计数板计数，计算细胞的浓度，并用培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养。
二、传代细胞的建系和维持
1、细胞档案
细胞档案要记录好，如组织来源、生物学特性（由形态、生长繁殖曲线、染色体核型情况、代谢特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有无支原体和潜存病毒等）、培养基的要求、传代换液时间、扩增时间（分裂指数），细胞的特殊遗传标志（标记染色体）等，这些记录对于保证细胞的正常生长，保持细胞的一致和经长期培养细胞特性的变异比较，都有十分重要的意义。
2、换液传代
（1）细胞系的传代、换液方法与前相同，但一般都有自身的规律性，因而在继续传代时，要注意保持其稳定的规律性，这样可以减少由于传代时细胞密度的频繁增减或换液时间的不规律而导致细胞生长特性的改变，给以后的实验带来影响。
（2）AU565 [AU-565]细胞多种细胞系维持传代，要严格操作程序，对所用的试剂各系不能交叉。每传5代后，细胞种子均应冻存。传代时均应作好记录，培养瓶上要有明显标记，标记细胞系名称和传代的代数及传代时间。细胞种子的及时冻存不仅可防止污染丢失，而且还可防止因盲目传代而造成细胞变异，此外还可提供不同代次的细胞同时进行对比试验。
3、细胞系（或株）的鉴定和管理。