膜蛋白提取试剂盒

细胞蛋白提取
1. 提取液准备：
每500μl冷的蛋白提取液A中加入2μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
每500μl膜蛋白溶解液C中加入2μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取5-10×106个以上细胞，在4℃，500×g条件下离心3-5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 细胞样品中加入200μl-400μl冷的试剂 A，充分混匀。
5. 在2-8℃条件下振荡20-30分钟，至细胞充分裂解，细胞沉淀明显减少。
6. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
7. 将上清吸入另一干净离心管，在37℃水浴5-10分钟。
8. 在37℃，1000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为30-50μl。
9. 小心移除上层液体，收集上层部分留作备用分析。
10. 用150-200μl冰冷的试剂B充分溶解下层膜蛋白部分，混匀后冰浴2分钟，37℃水浴5-10分钟，37℃，1000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为30-50μl。小心移除上层液体，保留下层。
11. 按以上步骤再次抽提下层膜蛋白(此步骤可以选做，一般不需要做)。
12. 用50-200μl冷的试剂C膜蛋白溶解液溶解下层膜蛋白部分，即得膜蛋白。
13. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

组织蛋白提取
1. 提取液准备：
每500μl冷的蛋白提取液A中加入2μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
每500μl膜蛋白溶解液C中加入2μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取50mg-100mg适量组织样本，用冷PBS洗干净，然后用手术剪刀尽可能剪碎，加400μl冷的试剂 A，用组织匀浆机/器匀浆至无明显肉眼可见固体。
3. 将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在4℃条件下振荡20-30分钟。
4. 按照细胞蛋白的提取方法的第5步骤往下操作即可。

1.蛋白浓度低？
膜蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大细胞的上样量以提高膜蛋白浓度。
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。

2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。