革兰氏阴性细菌外膜囊泡制备试剂盒

外膜囊泡（outer membrane vesicle；OMV）为含有周质内容物（包括外膜蛋白、DNA、RNA、脂多糖、脂质、周质蛋白、黏附素、免疫调节化合物等）的球形电子致密芽状体（spherical bud），细胞外间隔体，双层磷脂，20至200纳米大小，来自于革兰氏阴性细菌周边突起物的释放形成或胞外分泌产物，使之与环境或宿主细胞进行反应，并调解各种功能，包括促进病理形成，调节细菌互动，转运各种信号分子（例如DNA、RNA、蛋白质、内毒素、毒力因子等），保护细菌生存、结合和侵入，引起毒性，产生抗生素抗性等。外膜囊泡的产量取决于细菌生长周期、营养条件、温度、氧化应激状态等。病原菌的外膜囊泡10倍于非病原菌体。外膜囊泡具有疫苗开发中免疫调节潜力。通过差速离心和蛋白酶抑制混合剂，获得高纯外膜囊泡，充分保留其蛋白质的免疫和生物学活性。

产品内容

HEPENGBIO保存液（Reagent A） 10毫升
HEPENGBIO溶解液（Reagent B） 5毫升
HEPENGBIO活性液（Reagent C） 25微升
产品说明书 1份

保存方式

保存HEPENGBIO活性液（Reagent C）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
分光光度仪：用于测定细菌浓度
台式离心机：用于样品操作
超速离心机：用于样品操作
恒温摇床：用于培养细菌细胞
0.45微米滤膜：用于样品操作
真空浓缩装置：用于样品操作


实验步骤

实验开始前，将试剂盒里的HEPENGBIO活性液（Reagent C）从－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里冻融，然后移出1毫升HEPENGBIO溶解液（Reagent B）到1.5毫升离心管，加入5微升HEPENGBIO活性液（Reagent C），充分混匀，置于冰槽里，标记为HEPENGBIO溶解工作液。然后进行下列操作。

1. 准备好1毫升过夜培养的新鲜细菌样品
2. 移取500微升到50毫升细菌培养液（注意：用户可以进行诱导培养，例如无铁培养等）
3. 放进37℃恒温摇床孵育过夜，速度为200RPM
4. 在分光光度仪上测OD600为1（1 OD＝1 X 10⁹细胞/毫升；总量为5 X 10¹⁰细胞）
5. 转移到预冷的50毫升锥形离心管
6. 放进4℃台式离心机离心30分钟，速度为5000g
7. 小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管
8. 重复实验步骤6和7一次
9. 使用0.45微米滤膜真空过滤一次
10. （选择步骤）使用100kD蛋白临界点浓缩处理
11. 放进4℃超速离心机离心3小时，速度为150000g
12. 小心抽去上清液
13. 加入200微升预冷的HEPENGBIO保存液（Reagent A）
14. 或加入200微升预冷的含有HEPENGBIO溶解液（Reagent B）和HEPENGBIO活性液（Reagent C）的HEPENGBIO溶解工作液
15. 用枪头上下抽吸，充分混匀
16. 转移到新的预冷的1.5毫升离心管
17. 即刻放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里备用
18. 进行后续蛋白定量、荧光定量或电镜检测等

注意事项

1. 本产品为20次（50毫升菌液）操作
2. 所有操作须在4℃状态下进行
3. 建议使用新鲜细菌接种，培养到指数生长阶段为理想状态
4. HEPENGBIO活性液（Reagent C）避免反复冻融
5. 本产品按照50毫升培养菌液配制。如果操作不同菌液容量，可相应调整试剂用量
6. 根据菌种不同，50毫升（OD600＝1）菌液可获得5至100微克外膜囊泡蛋白
7. 制备产物如果放在－70℃冰箱里储存备用，严格避免反复冻融
8. 本公司提供系列细菌试剂产品