植物P型氢ATP酶（H＋－ATPase）活性比色法定量检测试

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氢ATP酶（H^＋-ATPase；EC3.6.3.6），又称为质子或氢离子转位ATP酶（Proton-Translocating ATPases），在生物能量传导过程中起着重要作用。其分成三类：质膜型（plasma membrane type或P型）、真细菌型（eubacterial type或F型）和囊/液泡型（vacuolar type或V型）。质膜型存在于植物、酵母和胃酸分泌型囊泡的质膜上，约100kd蛋白；真细菌型存在于叶绿体、线粒体和细菌上，由疏水的膜部分和亲水的催化部分组成；囊/液泡型存在于真核生物细胞器的囊泡系统。其中植物质膜氢ATP酶，100kd分子量，是植物细胞膜上重要的功能酶，为植物生命活动的主要酶之一。氢ATP酶催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。这一去磷酸化反应释放出能量，成为细胞生命代谢的能源。同时利用细胞内ATP释放的能量逆向跨质膜把质子转运出细胞，产生并保持细胞膜或细胞器两侧氢离子的电化学梯度，为一系列次级转运体和通道蛋白对各种营养物质及离子的跨质膜转运提供能量。植物氢ATP酶还参与细胞内pH水平、细胞伸长、气孔开闭、以及植物对环境的应激反应等多种生理过程的调节。基于底物ATP，在排除其它，包括钙（EGTA处理）、钠钾（乌本苷；ouabain处理）和氢钾（奥美拉唑；omeprazole）等ATP酶的干扰下，在P型氢ATP酶敏感性抑制剂原钒酸盐（orthovanadate）存在与否的情况下，受到P型氢ATP酶的水解，进而通过bing酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的变化（340nm），来定量分析P型氢ATP酶的活性。其反应系统为：

产品内容

HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO酶促液（Reagent D） 毫升
HEPENGBIO反应液（Reagent E） 毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent F） 毫升
HEPENGBIO阴性液（Reagent G） 毫升
HEPENGBIO专性液（Reagent H） 微升
产品说明书 1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；HEPENGBIO底物液（Reagent F），避免光照，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
DOUNCE匀浆器：用于组织匀化
微型台式离心机：用于样品制备
培养箱：用于反应孵育
比色皿：用于光度分析的容器
分光光度仪：用于光度分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；HEPENGBIO底物液（Reagent F）注意避光；HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）室温下预热。然后进行下列操作。

• 样品准备（总蛋白制备）

1. 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定组织重量
2. （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3. （选择步骤）加入适量的（1克组织需要3毫升）HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4. 即刻用刀片切碎组织
5. 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
6. 加入预冷的xx毫升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
7. 涡旋震荡5秒，充分混匀
8. 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）
9. 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管，放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
10. 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管
11. （选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
12. 即刻移入到1.5毫升离心管
13. 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）
14. 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、测定准备

1. 准备好待测样品（例如植物组织细胞裂解样品等），置于冰槽里
2. 设定好分光光度仪（温度为28℃）：波长为340nm，间隔5分钟，读数7次（共30分钟），并置零

• 背景对照测定

1. 移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3. 加入xx微升HEPENGBIO反应液（Reagent E