小鼠海马神经元细胞原代分离培养

新生24h 内清洁级C57小鼠若干，客户提供。
二、主要仪器及试剂
1、主要实验仪器

2、主要试剂

3、主要试剂配制
（1）PBS磷酸盐缓冲液： PBS粉剂每袋加ddH₂O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min高压灭菌，44℃冰箱保存。
（2）接种液的配制：按胎牛血清与DMEM-F12培养液体积比1：10，无菌条件下加入1%体积分数的双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL，置于4℃冰箱保存。
（3）神经细胞维持培养液（无血清培养液）的制备 ：Neurobasal；2%B-27；1% 0.5mmol/L L-谷氨酰胺；1%青链霉素。换液前 3h 配制，置于4℃备用。
（4）0.01% L-多聚赖氨酸溶液的配制：称量 10mg L-多聚赖氨酸，溶于 100ml 灭菌去离子水，0.22μm 正压滤器过滤分装，-20℃保存。
（5）阿糖胞苷溶液的制备：
a. Ara-C 储存液：称量 Ara-C 0.01g，溶于25mL去离子水中，即成 1.4mmol/L储备液。0.22μm 正压滤器过滤分装，置-20℃冰箱储存。
b. Ara-C 工作液： Ara-C储存液与无血清培养基以1:3 体积比配制成浓度为100µg/mL 的溶液。使用时按照培养液与100µg/mL的Ara-C体积比40:1 稀释，即Ara-C的工作浓度为2.5µg/mL。
（6）0.4%台盼蓝溶液的配制：台盼蓝4 g，PBS少许（研磨），PBS定容至100mL，滤纸过滤，室温保存。
（7）四噻唑兰溶液配制：MTT50mg，PBS10mL磁力搅拌30min，0.22µm 微孔滤膜过滤分装，4℃保存，2周有效。
三、细胞操作实验方法
1、小鼠海马神经元细胞的原代分离培养
（1）培养板的包被
用0.01%的 L-多聚赖氨酸溶液包被培养板和小玻片，37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。
吸弃 L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。

2、小鼠海马神经元细胞的分离及培养
（1）75%（体积分数）酒精消毒新生24h内的健康C57小鼠，在无菌条件下脱颈处死，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2，无钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。
（2）无菌分离海马组织。保持脑组织背面朝上，在镜下小心翻开大脑皮质，暴露海马，用眼科剪或尖镊分离海马周围组织，取出放入盛有D-Hank's液的平皿中。
（3）用虹膜剪将组织剪切成1mm³左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 20min，期间振摇 2~3 次。
（4）弃去上清液，加入完全接种液终止消化，漂洗2次。巴斯德吸管轻轻吹打 20次，制成细胞悬液，静置 2min。
（5）悬液收集于新的离心管，离心（1000rpm，10 min，4℃），弃去上清液。加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。
（6）将滤液进行台盼蓝拒染试验,血细胞计数板镜下计数。以 8.0 ×10⁴至 1.0 ×10⁵/mL的密度将细胞以400µL/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24孔培养板或 100µL/孔接种 96 孔培养板。
（7）置 37℃、5%CO₂培养箱培养 4-6h，全量更换为无血清培养液。
（8）体外培养第3d，加入Ara-C-工作液，以抑制非神经细胞过度增殖，作用 24 h后吸出。
（9）此后每 3d半量换液1次 , 体外培养第 7～21d的细胞用于实验。

四、无菌操作注意事项
细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

五、威斯腾生物服务流程

六、威斯腾生物服务项目

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