核酸外切酶 III（E. coli）

特别提示：包括核酸外切酶 III（E. coli）在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：核酸外切酶 III（E. coli）
英文名称：Exonuclease III (E. coli)
产品货号：SV1086
产品规格：25KU|5KU|2500U

特性:
3´ →5´ 外切酶活性
非定向巢式缺失
定点突变
链特异性探针的制备
制备用于双脱氧测序的单链底物
概述:
该酶作用于双链 DNA，从 3´ OH 末端方向逐步切去单核苷酸。每次酶与底物结合催化，只有几个核苷酸被除掉，从而在 DNA 分子群内产生渐进缺失。
尽管可以作用于双链 DNA 的切刻产生单链缺口，但该酶最适底物是平齐末端或 3´ 凹陷末端 DNA。由于对单链 DNA 无活性，因此该酶无法切割 3´ 突出末端。3´ →5´ 外切酶活性对底物的切割程度随 3´ 突出末端的长度而变化，四碱基或更长的突出末端完全不能被切割。这种特性:可以用于对一端为抗性位点（3´ 突出端），另一端是敏感位点（平端或 5´ 突出端）的线性 DNA 分子进行单方向切割。
核酸外切酶 III 的活性部分依赖螺旋结构，并根据序列的不同而有差异（C＞A=T＞G）。温度、盐浓度:和酶与 DNA的比例对酶活性影响很大，应根据不同的反应调整反应条件:。
据报道，核酸外切酶 III 也有 RNase H、3´ -磷酸酶和脱嘌呤/嘧啶-核酸内切酶活性。
来源:
纯化自 E. coli K-12，BE257/pSGR3 菌株（B.Weiss 惠赠）。
反应条件:
1X BalbBuffer 1
[10 mM Bis Tris 丙*-HCl，10 mM MgCl2，1 mM DTT（pH 7.0 @ 25℃）]，37℃ 温育。
热失活:70℃ 加热 20 分钟。
质保声明:
核酸外切酶 III 经过严格的质控检测，确保该产品具有最高的活性和纯度。
单位定义:
1 单位指 50 μl 反应体系中，37℃ 条件下，30 分钟催化产生 1 nmol 酸溶性总核苷酸所需要的酶量。
浓度:
100,000 units/ml。
注意事项:
核酸外切酶 III 不能切割硫代磷酸酯键。因此，也可以通过引入一个 α-硫代磷酸核苷酸将 DNA 分子的一端保护起来，以进行单向切割。

除了核酸外切酶 III（E. coli）,，我公司还供应以下相关产品：



名称：Klenow片段(无外切酶活性)
货号：YT510
规格：100U
本酶是没有外切酶活性的Klenow片段，是大肠杆菌聚合酶I(E.coli.DNA polymerase I)的大片段(Large Fragment)缺失了外切酶活性的突变体。Klenow Fragment，Exo-保留了DNA聚合酶I的5"→3"聚合酶活性，但缺少完整的Klenow酶的5"→3"和3"→5"外切酶活性。

特点：由于Klenow Fragment，Exo-没有外切酶活性，其在末端补平时经常会在3"末端额外加上1个或多个核苷酸，因此不能用于产生平末端而用于后续的连接。
用途：5"突出末端的标记；随机引物法进行DNA标记；Sanger双脱氧法进行DNA测序等。
来源：由大肠杆菌表达，表达基因的来源为突变的 polA 基因片段。
分子量：约68kDa(单体)。
活性定义：37℃30分钟内，催化10nmol脱氧核糖核苷酸(dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。
酶活性检测条件：67mM potassium phosphate(pH7.4)，6.7mM MgCl2，1mM 2-mercaptoethanol，0.033mM dATP，0.033mM dTTP，0.4MBq/ml[3H]-dTTP，62.5μg/ml poly(dA-dT)·poly(dA-dT)。
纯度：不含DNA内切酶，不含RNase。
酶储存溶液：25mM Tris-HCl(pH7.5)，0.1mM EDTA，1mM DTT，50%(v/v)glycerol。
Reaction Buffer(10X)：500mM Tris-HCl(pH8.0 at 25℃)，50mM MgCl2， 10mM DTT。
失活或抑制：75℃加热10分钟或加入适量EDTA均可导致Klenow Fragment，Exo-失活。金属离子螯合剂，无机焦磷酸盐(PPi)，大剂量的无机磷酸盐(Pi)均对Klenow Fragment，Exo-有抑制作用。
储存条件：-20℃。

使用说明：

1. 随机引物法进行DNA标记：
a. 参考如下表格设置反应体系：
DNA———————————————————————————————10µl(100ng)
Reaction Buffer (10X)——————————————————————5µl
125µM random decamer or hexamer primer——————————————10µl
补充无核酸酶的去离子水——————————————————————至40μl
混匀后沸水浴孵育5-10分钟，立即置于冰浴冷却。进行后续步骤前离心沉淀液
3 dNTP Mixture (0.25mM each , without the labeled—————————4μl
[α-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol (3000Ci/mmol)————————————1.85MBq (50μCi)
Klenow Fragment，Exo-———————————————————————1µl (5U)
补充无核酸酶的去离子水———————————————————————至50µl
b. 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 对于random decamer primer，37℃孵育5分钟；对于random hexamer primer，37℃孵育10分钟。
d. 加入4μl 0.25mM dNTP，混匀后37℃孵育5分钟。
e. 加入1μl 0.5M EDTA，pH8.0终止反应。
f. 取1μl上述液体用于检测标记的效率。
g. 用Sephadex G-50或Bio-Gel P-60或其它适当试剂盒纯化标记好的探针。

2. 双链DNA 5’突出(5’ overhang)末端的标记：
a. 参考如下表格设置反应体系：
Digested DNA ——————————————————————————10~15µl(0.1~4μg)
Reaction Buffer (10X)——————————————————————2µl
[α-32P]-dNTP, ~15-30 TBq/mmol(400-800Ci/mmol) —————————0.74 MBq(20μCi)
或 [α-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol(3000Ci/mmol)———————————2.96 MBq(80μCi)
3 dNTP Mixture (2.5mM each , without the labeled）————————2μl
Klenow Fragment，Exo-———————————————————————0.2μl (1U)
补充无核酸酶的去离子水———————————————————————至20µl
b. 按上述体系配好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 30℃孵育15分钟。
d. 75℃孵育10分钟终止反应。

3. 其他用途可以参考上述用途或适当的文献资料进行。