T4连接酶

特别提示：包括T4连接酶在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：T4连接酶
英文名称：T4 DNA Ligase
产品规格：28KU

  T4 DNA连接酶常用于催化双链DNA平末端或互补粘性末端之间的 连接反应，也能催化双链RNA 5′-磷酸末端和3′-羟基末端间的连接。还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口。以上反应均需消耗ATP。

产品组成：

组份	体积
T4 DNA连接酶 （350U/μl）	80μl
2×Quick Ligation Buffer	1ml
10×T4 DNA Ligation Buffer	1ml

产品特点：
随酶附带10×T4 DNA Ligation Buffer及独特配方的2×Quick Ligation Buffer提供给您更多的选择：而使用10×T4 DNA Ligation Buffer，16℃过夜连接可获得最高的连接效率；使用快连Buffer在室 温(25℃)下，仅需5分钟即可完成粘性末端或平滑末端DNA片段的连接 反应。

产品用途：
1、DNA片段和载体DNA的连接。（参见实验方案）。
2、DNA片段和Linker或Adaptor DNA的连接。

使用建议：
1、粘末端的连接反应：插入片段和载体的摩尔浓度比特别重要，此比例在2-6之间最好，低于2:1就会导致较低的连接效率，高于6:1则会导致多个插入。摩尔比请按载体与插入片段DNA浓度及分子大小来计算。
2、平滑末端的连接反应：平滑末端的连接反应与突出末端相比反应较慢(其Km值约为突出末端的100倍)。进行平滑末端的连接反应时，可提高DNA浓度，将使用酶量增加到突出末端量的2～5倍左右。
3、向粘粒或噬菌体进行连接反应：可使载体和插入DNA的摩尔比调整为1:1，同时增大DNA浓度以便取得良好效果。(0.05～0.1μg／μl以上)
4、反应温度： 该酶的最适温度为37℃，由于热稳定性较差，因此 长时间反应时通常需在16℃下进行。若反应1-2小时左右的话也可在室 温下进行反应。
5、抑制剂：T4 DNA连接酶要求Mg2+，因此螯合Mg2+的EDTA的存在会阻碍反应。将溶解于含有高浓度EDTA缓冲液中的DNA准备作为样品使用，最好先用灭菌蒸馏水或TE缓冲液进行置换。

应用实例：

图 例 1 ） 在25℃，用不同活性单位（2U、4U、6U）T4 DNA连接酶与λDNA/Hind III 片段作用10分钟后的结果以及连接产物灭活T4连接酶后再次使用Hind III酶切结果。
泳道1：λDNA/Hind III；
泳道2：λDNA/Hind III+2U T4 Ligase；
泳道3：λDNA/Hind III+4U T4 Ligase；
泳道4：λDNA/Hind III+6U T4 Ligase；
泳道5：λDNA/Hind III ,T4 Ligase连接产物，Hind III酶切

活性定义：在20μl的连接反应体系中, 6μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时, 有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个单位。

质量保证：经多次柱纯化，SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一的目的条带；PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留，无核酸内、外切酶污染。

快速连接步骤：
1、取50 ng载体和3倍摩尔量的插入片段，用双蒸水调整总体积为10μl。
2、加入10μl 2×Quick Ligation Buffer，混匀。
3、加入0.5～1μl T4 DNA连接酶，充分但轻柔混匀（切勿剧烈震荡，可能导致酶部分失活）。
4、稍事离心，置于室温 (25℃) 作用5分钟。
5、冰上放置，转化（如不立即进行转化实验请冻 存于-20℃）