图 1. EvaGreen® dye binds to dsDNA via a “release-on-demand” mechanism.
图2. EvaGreen无毒,无致突变性,对水生生物无危害性。
EvaGreen 是一种用于实时定量 PCR ( qPCR )的 DNA 结合染料。该染料的诸多优点使它远胜于 SYBR Green I 。除了有相似的光谱特性, EvaGreen 有三个主要特点使它区别于 SYBR Green I 。
首先, EvaGreen 对 PCR 的抑制性远小于 SYBR Green I 。因此,使用 EvaGreen 进行的 qPCR 实验可以使用快速 PCR 步骤。同时, EvaGreen 在实验中可以使用较高的浓度,从而获得远强于 SYBR Green I 扩增信号(图 3)。较高浓度的 EvaGreen 也消除了“染料重分布”的缺陷,使 EvaGreen 既可用于多重 PCR ,也可用于高分辨率(高清晰)熔解曲线分析( HRM )(图 4 )。该分析正被越来越多的用于 PCR 后的基因分型和异源双链分析 。由于 SYBR Green I 对 PCR 的抑制性,从而要求其使用浓度必须很低,因此 SYBR Green I 无法解决由低浓度造成的染料重分布问题,既不能用于多重 PCR 也不能用于 HRM 。同时,染料重分布问题也可能影响常规熔解曲线的可靠性,因为低熔点的 DNA 链可能由于这种原因而无法检测到 。
特性:
极高的灵敏度
在推荐浓度下使用时可以获得最强的 PCR 扩增信号。
PCR 抑制性极小
智能化的“按要求释放” DNA 结合技术使得 EvaGreen 对 PCR 的抑制远小于 SYBR Green I 。
和快速 PCR 兼容
对 PCR 干扰极小,从而极大的缩短了 PCR 延伸时间。
非常适合 HRM 分析
无“染料重分布”缺陷,兼容 PCR 后的高分辨率熔解曲线( HRM )分析。
兼容多重 PCR
在推荐浓度下使用时,无扩增子之间的染料迁移现象。
超强稳定性
在大部分生化条件下非常稳定,可在室温下储存并可反复冻融。
安全性好
图6 细胞膜穿透性测试表明,EvaGreen几乎不能穿透细胞膜,安全性高
优越的兼容性
和 SYBR GREEN I 光谱相似,和各知名品牌的 qPCR 仪器兼容。 用 EvaGreen 替代 SYBR Green 1 ,毋须改变任何您目前使用的操作步骤和仪器设备。
第二, EvaGreen 的稳定性极好。在正常的储存、操作和 PCR 过程中不会被破坏。在缓冲溶液中的染料可以安全的储存在室温或冰箱里,也可以反复冻融。与之相反, SYBR Green I 不稳定而且降解后对 PCR 抑制性更强 。
EvaGreen 降低了细胞膜透性,因而比 SYBR Green 1 更加安全。独立实验室的测试结果显示, EvaGreen 既没有诱变性也没有细胞毒性 。相反,虽然 SYBR Green I 本身诱变性很弱,但它在细胞中可能抑制了正常 DNA 的修复机制,使其有诱变增强作用 。考虑到 PCR 的广泛使用,其安全性应该得到足够重视。
图3. 比较Biotium公司的 Fast EvaGreen master mix (green)和 ABI (blue) 和 Qiagen (red)fast SYBR Green master mixes, 显示相比 SYBR Green,EvaGreen 有着超级灵明度。
( A fragment of ATPG was amplified from varying amounts of human genomic DNA (200 ng to 20 pg) using an ABI 7900 Fast thermocycler.)