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- 2025年07月16日
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【技术原理】
多重荧光免疫组化，主要的技术原理来自TSA技术，TSA即酪酰胺信号放大技术(Tyramide signal amplification)，是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。该技术可与高性能染料Alexa Fluor、传统荧光染料和比色检测系统相兼容。
简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。
然后微波处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还留存在样品上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。
【技术优势】
1.由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。
2.TSA技术可以用于检测用传统方法无法检出的低丰度靶标。基于酪酰胺的信号放大技术能够提供极强的敏感度、检测极微量的目的抗原。极大的降低抗体的用量，节约抗体，实测确实可以显著提升抗体的稀释比例。
3. 荧光法多重免疫组化，可同时进行五个颜色通道以上，这种情况下发射光谱会重叠，我们可以借助多光谱成像系统来解决这个问题。这是传统间接荧光法染色和显色法多重免疫组化所做不到的。这种方法能真实反映关键蛋白的表达情况和相互之间的关系，从而极大地节约珍贵的样品。
【多色服务】
* 我们可以提供的服务：
多重荧光免疫组化服务提供预实验验证-染色-拍照-分析全过程。
最多六指标七色（含DAPI）的多色免疫组化服务（芯片最多四指标五色），样本涵盖石蜡切片、冰冻切片及组织芯片（TMA），组织大片请提供单块组织切片，FFPE样本，厚度3-5um。正式实验最好每例2张，1张备用。预实验样本数量根据预实验方案定。
(* 所有抗体指标需要您提供)
* 我们可以提供的服务结果：
1.五色及以下提供全片200X（相当于物镜20X，目镜10X）原图，六七色提供指定视野200X图片，选定视野一般默认3视野，超过视野单独收费，收费标准根据具体情况订，提供看图软件可在客户端打开。数据上传网盘1G以内，或用U盘寄送1G以上。
2.客户指定区域的单细胞分析结果：
单阳性细胞占有核细胞百分比，密度。
双阳性细胞占有核细胞百分比，密度。
组织面积和特定病理形态面积计算。
TMA提供每个芯点的以上定量结果。
【结果案例展示】
1.人 T细胞活化状态检测 CD3 CD69 HLA-DR
2.类器官体外检测、肿瘤标志物检测
3.同源小鼠肿瘤PD实验
【代表文献（精选)】
Zaretsky, J. M., et al. (2016). "Mutations Associated with Acquired Re-sistance to PD-1 Blockade in Melanoma." N Engl J Med 375(9): 819-29. IF 59.558
Nghiem, P. T., et al. (2016). "PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Ad-vanced Merkel-Cell Carcinoma." N Engl J Med 374(26): 2542-52. IF 59.558
Nature. 2015 November 26; 527(7579): 525–530. doi:10.1038/nature16064.
中山大学郑利民教授 The Journal of Clinical Investigation,J Clin Invest. 2019.
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文献和实验越来越多的证据表明多重荧光免疫组化 (multiplex immunohistochemistry, mIHC)，又称多重免疫荧光 (multiplex immunofluorescence, mIF) 技术的稳健性和预测价值。利用多重荧光免疫组化（mIHC）/ 多重免疫荧光（mIF）进行多重成像的空间生物标志物分析有望在发现研究和临床阶段的研究中得到广泛采用。 越来越多的实验室报道正在使用 Opal 多重荧光免疫组化优化为可重复的工作流程，为该技术的稳健性和预测价值提供了很多证据
8 色多重荧光免疫组化方法揭示补体在早期类风湿关节炎发展中的作用
关节炎病理研究项目）的样本进行了研究。 这项研究主要（1）检测了补体激活途径、受体和调节基因的表达，以及它们与滑膜和血液中 DAS28-ESR（关节疾病活动评分）临床疾病严重程度 的相关性的研究。（2）使用 Akoya Biosciences PhenoImager 8 色多重荧光免疫组化方案，检测了滑膜中关键蛋白的局部表达和病理生理变化，揭示了可能促进局部补体激活的激活和抑制因子的区域改变的重要证据。 表 I. 分析补体和 FcgR 基因在PEAC研究项目样本血液和滑膜粘液中的表达水平 研究
是指用不同波长激光轮流照射样品，同时在相应的荧光检测通道轮流采集，并显示每种荧光的共聚焦图像。对于双重荧光染色样品其具体操作过程是：首先只用一种激光激发相应的第一种荧光物质，在第一通道显示其荧光图像；再用另一种激光激发另一种荧光物质，在第二通道显示其荧光图像。相应的顺序扫描软件能够将两通道的不同荧光图像同时分通道显示并叠加合成，展示出两荧光间空间定位关系。依此类推，用顺序扫描方法还可以采集三重或更多重荧光样品的图像。 4. 修改光谱检测仪器的检测条件：在图像上出现比较弱的荧光交叉信号时
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