miRNA靶基因预测和鉴定服务

miRNA靶基因鉴定
靶基因鉴定是阐明miRNA作用机制的关键，如何预测和验证靶基因是所有miRNA研究工作者面临并需要解决的难题。
Geneup公司使用多种在线工具免费为您进行miRNAs靶基因的预测，并结合现有各种基因数据库与miRNAs功能数据库，
为您提供最可靠的判断。所有miRNA靶基因的预测结果必须通过各种实验手段进行验证，主要包括：

• 靶基因3’ -UTR荧光素酶报告实验；
• 蛋白质水平验证miRNA过表达或抑制表达与靶基因蛋白水平的关系。

（一）靶基因3’-UTR荧光素酶报告基因载体
Geneup公司利用两种荧光素酶报告基因检测系统，构建miRNA候选靶基因3`-UTR的载体，通过萤光素酶活性检测，确定miRNA与靶基因3`-UTR的关系。
1.单荧光素酶(F.Luc)报告载体pFLuc载体图谱：


载体特点：

• 用SV40启动子驱动萤火虫荧光素酶报告基因（F.Luc）的表达；
• 氨苄抗性筛选基因；
• 通过EcoRI- XbaI双酶切后插入3’-UTR。

检测原理：
将miRNA过表达载体或对照载体、及携带3`-UTR的pSL-UTR质粒和含有海肾萤光素酶报告基因（R.Luc）的
内参载体（pRL-con-vector）共转染哺乳动物细胞，然后检测萤光素酶表达水平。相对于对照载体，如果
miRNA过表达载体使萤火虫荧光素酶表达水平下降，说明miRNA能特异结合该3`-UTR，该基因可能为miRNA的靶基因。

2、双荧光素酶(F.Luc/R.Luc)报告基因载体：pdLuc
载体图谱：

载体特点：

• 用PGK启动子驱动萤火虫荧光素酶报告基因（F.Luc）的表达，同一载体上另一个报告基因是由SV40启动子控制下的
• 海肾萤光素酶-新霉素基因融合蛋白基因（R.luc-Neo），用于归一化处理和阳性筛选；
• 可以用G418进行稳转细胞的筛选；
• 3`-UTR多克隆位点是EcoRI-XhoI

检测原理：
将miRNA过表达载体或对照载体、及携带3`-UTR的pdLuc-UTR质粒共转染哺乳动物细胞，然后检测萤光素酶表达水平。
相对于对照载体，如果miRNA过表达载体使萤火虫荧光素酶表达水平下降，说明miRNA能特异结合该3’-UTR，该基因可能为miRNA的靶基因。

（二） 靶基因UTR产品及服务列表
服务项目：

• 靶基因3’-UTR载体构建：请提供靶基因的名称(GenBank Accession no.)，需要克隆的靶基因UTR的范围（大小在0.5 kb以内最为理想，建议不要超过1 kb）；选择待克隆的载体。
• 3’-UTR实验分析：分析3’-UTR报告基因活性，鉴定miRNA的靶基因；miRNA过表达质粒可由客户提供或由Geneup公司构建。
• 3’-UTR突变分析：分析3’-UTR-mut报告基因活性，进一步鉴定miRNA的靶基因。

服务流程：

• PCR扩增靶基因的3’-UTR，或直接合成结合位点序列；
• 将上述DNA片段克隆至报告载体，并测序；
• 构建3’-UTR突变载体，并测序；
• 构建miRNA 表达载体；
• 将3’-UTR报告载体（或突变载体）与miRNA过表达载体（或对照载体）共转染细胞；
• 双荧光素酶表达水平测定。

服务内容	服务周期
3’-UTR荧光素酶报告载体构建服务	20个工作日
3’-UTR突变荧光素酶报告载体构建服务	20个工作日
3’-UTR荧光素酶报告基因检测服务	20个工作日
3’-UTR突变荧光素酶报告基因检测服务	20个工作日
Western blot检测服务	30个工作日

注：3’-UTR序列长度应<1Kb，随着构建序列长度越长，构建难度加大，价格相应增加。