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RevertAid™ Premium First Stran

d cDNA Synthesis Kit
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  • Thermo scientific -fermentas
  • K1651
  • 2025年10月24日
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    • - -20°C保存
    Catalog# Size, concentration Certificate of Analysis MSDS
    K1651 for 20 react. K1651
    K1652 for 100 react. K1652

    Features

    • 高通量地制备长达20 kb的全长cDNA。
    • 在从45°C 到60°C 的宽温度范围内高效合成cDNA。
    • 提高的合成效率– 在30分钟内完成cDNA合成。
    • 高敏感度和特异性。
    Applications

    • 第一链cDNA合成。
    • RT- PCR。
    • RT-qPCR。
    • cDNA文库构建。
    • 合成杂交探针。
    • RNA扩增。
    说明
    The RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit是一个高效合成第一链cDNA的完整体系.该试剂盒采用了RevertAid™ Premium Reverse Transcriptase (RT),这是一个从M-MuLV RT进化衍生出的高效逆转录酶。该酶是M-MuLV RT的衍生酶中具备最好的热稳定性的酶,并且没有RNase H活性。RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit可以在提升温度(可高至60°C)的情况下的合成长达20 kb的长cDNA,取代了其他体系合成全长cDNA的能力。由于提高了酶的第一链cDNA合成率,反应能在30分钟内完成。

    RevertAid™ Premium Enzyme Mix 包含 RevertAid™ Premium逆转录酶 和 RiboLock™ RNase 抑制剂. RiboLock™ RNase抑制剂有效保护RNA模板在温度高至55°C的情况下不被RNases A, B and C降解。

    Oligo(dT)18 and random hexamer primers 与试剂盒配套提供。随机六聚体引物的非特异结合性被用来从全部的总RNA群体中合成cDNA。oligo(dT)18 引物有选择地退火到poly(A) RNA的3’端,仅从有poly (A) 尾的mRNA合成cDNA。基因特异性引物也可以配合这个试剂盒使用,以从特定的序列进行首要的合成。

    Water, nuclease-free 被用来搭建反应体系和溶解样品DNA。这个水经相应的质量检测确定没有内切,外切脱氧核糖核酸酶,核糖核酸酶和磷酸酶的污染。


    质量控制
    已进行了功能测试,采用100 fg的对照GAPDH RNA 和GAPDH 对照引物,RT-PCR后经1%琼脂糖胶电泳,溴化乙锭染色后鉴定得到496 bp的明显产物。

    组分
    • RevertAid™ Premium Enzyme Mix
    • 5X RT Buffer
    • dNTP Mix, 10 mM each
    • Oligo(dT)18 Primer
    • Random Hexamer Primer
    • Water, nuclease-free
    • 详细的使用说明


    图1。两步RT-PCR扩增长至20kb的目的片段. 。
    1 µg Jurkat细胞总RNA (1 and 2)或小鼠骨骼肌总RNA (3 and 4)在采用RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录反应中应用。合成的cDNA在后续的使用Long PCR Enzyme Mix (#K0181)及不同基因特定引物的PCR反应中用作模板:
    3.9 kb – BCL2 (人 B-cell CLL/淋巴瘤2)
    6.8 kb – POLE (人聚合酶)
    13.3 kb – Dmd (小鼠 dystrophin蛋白)
    20.2 kb – Neb (小鼠nebulin蛋白)
    M – GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder (#SM1331)
    图2。在宽温度范围内有效合成cDNA。
    在从45°C 到 60°C的温度下,1 µg Jurkat细胞总RNA (1 and 2)在采用RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit和Oligo(dT)18 引物的逆转录反应中应用。不同长度的扩增子(0.5 kb, 3.9 kb, 6.8 kb 和 9.4 kb)在使用Long PCR Enzyme Mix (#K0181)的情况下,由温度高至60°C的范围内合成的 cDNA成功扩增出来。
    图3。采用RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit在50°C 的高合成率。
    采用RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit 和其他的 第一链 cDNA 合成试剂盒在50°C 和5, 15, 30及 60分钟时以7.5 kb RNA转录物为模板合成。反应产物在1%的碱性琼脂糖凝胶上鉴定。RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit在5分钟内完成7.5 kb转录物的合成。
    图4。RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit在两步RT-PCR的更高的敏感度 。
    Jurkat细胞总RNA (100 pg, 10 pg, 1 pg and 0.1pg)在50°C 时使用RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit和42°C 时使用其他基于M-MuLV RT的试剂盒 ,逆转录反应以Oligo(dT)18 为引物在20 µl体系中进行。PCR采用2 µl 的逆转录反应混合物,Maxima® Hot Start Taq DNA Polymerase (#EP0601) 和GAPDH 基因的特定引物。

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