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- Thermo scientific -fermentas
- EP0741
- 2025年11月04日
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|
| Catalog# | Size, concentration | Supplied with: | Certificate of Analysis | MSDS |
| 5X RT Buffer | ||||
| EP0741 | 2000 u (200 u/µl) | 1.00 ml | EP0741 | |
| EP0742 | 10,000 u (200 u/µl) | 1.00 ml | EP0742 | |
| EP0743 | 4 x 10,000 u (200 u/µl) | 2 x 1.00 ml | EP0743 |
- Features
-
- 高通量地制备长达20 kb的全长cDNA。
- 活性温度可高达60°C。
- 热稳定 – 在50°C 的反应物中孵育 60 分钟仍有90%的活性。
- 高效 – 15-30分钟全合成cDNA。
- 高敏感度 – 以宽范围(0.01 pg – 5 μg)的起始RNA量可重复性地合成cDNA。
- 可结合修饰的核苷酸。
- Applications
-
- 两步RT-PCR。
- 两步RT-qPCR。
- 第一链 cDNA合成。
- 全长cDNA文库的构建。
- DNA 标记。
- 引物延伸。
说明
Maxima® Reverse Transcriptase由Fermentas 公司通过小鼠白细胞病毒逆转录酶(M-MuLV RT)的体外进化研发而成。该酶具RNA依赖和DNA依赖的聚合酶的活性以及核糖核酸酶H活性。该工程酶与野生型的M-MuLV RT相比，热稳定性，耐用性大大增强，并且合成效率也有所提高。
Maxima® Reverse Transcriptase能以宽范围(0.01 pg – 5 μg)的初始RNA量在提高的温度下(50-60°C)可重复性地合成cDNA，使之成为两步RT-qPCR的一个理想工具（见图５）。
由于它的高热稳定性（见图1）,这个酶在整个逆转录反应过程中保持全效活性，合成高产量的cDNA，并且能合成长度长达20 kb的很长的 RNA转录片段（见图２）。反应温度也可以提高至60°C 以高效转录带有大量二级结构RNA区域或者采用基因特异性引物提高转录特异性。由于合成速度的提高，逆转录酶的反应能在15到30 分钟完成（见图4）。
来源
E.coli 细胞含有来源于Moloney Murine Leukemia病毒的基因工程化的pol 基因片段。
活性单位定义
1个活性单位是指在37°C、10分钟内将1 nmol dTMP合成掺入多聚的核苷酸片段(吸附在DE-81上)所需的酶量。
酶活性分析混合物：50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 4 mM MgCl2 , 10 mM DTT, 50 mM KCl, 0.5 mM dTTP, 0.4 MBq/ml [3 H]-dTTP, 0.4 mM polyA "oligo(dT)12-18 。
保存缓冲液
保存缓冲液组分：
50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.1% (v/v) Triton X-100和50% (v/v)甘油。
50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.1% (v/v) Triton X-100和50% (v/v)甘油。
5X RT缓冲液
250 mM Tris-HCl (pH 8.3, 25°C), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2 , 50 mM DTT。
质量控制
相关测试表明无内切和外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷酸酶污染。 功能测试：第一链cDNA合成。
抑制与失活
- 抑制剂：金属螯合剂、无机磷酸盐、焦磷酸盐和多聚胺。
- 85°C热处理5分钟失活。
图1。Maxima® Reverse Transcriptase在50°C的高热稳定性逆转录酶在1X反应缓冲液中孵育。
在标明的时间点（5-240分钟），酶的活性由标准活性分析确定。
在标明的时间点（5-240分钟），酶的活性由标准活性分析确定。
图2。二步RT-PCR 扩增长达20 kb 的目的片段。
1 µg从Jukat细胞（1和 ）或者从小鼠（3和 4）中提取的总RNA在Maxima® Reverse transcriptase和其他逆转录酶的最佳反应条件时应用。合成的cDNA 在有Long PCR Enzyme Mix （#K0181）和不同基因的特定引物下作为PCR的模板：
1 – 6.8 kb POLE（人聚合酶）
2 – 9.4 kb FBN1（人原纤维蛋白1）
3 – 13.3 kb小鼠 distrophine蛋白
4 – 20.0 kb 小鼠nebuline蛋白
M – GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder (#SM1331)
1 µg从Jukat细胞（1和 ）或者从小鼠（3和 4）中提取的总RNA在Maxima® Reverse transcriptase和其他逆转录酶的最佳反应条件时应用。合成的cDNA 在有Long PCR Enzyme Mix （#K0181）和不同基因的特定引物下作为PCR的模板：
1 – 6.8 kb POLE（人聚合酶）
2 – 9.4 kb FBN1（人原纤维蛋白1）
3 – 13.3 kb小鼠 distrophine蛋白
4 – 20.0 kb 小鼠nebuline蛋白
M – GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder (#SM1331)
图2。二步RT-PCR 扩增长达20 kb 的目的片段。
1 µg从Jukat细胞（1和 ）或者从小鼠（3和 4）中提取的总RNA在Maxima® Reverse transcriptase和其他逆转录酶的最佳反应条件时应用。合成的cDNA 在有Long PCR Enzyme Mix （#K0181）和不同基因的特定引物下作为PCR的模板：
1 – 6.8 kb POLE（人聚合酶）
2 – 9.4 kb FBN1（人原纤维蛋白1）
3 – 13.3 kb Dmd (小鼠 distrophine蛋白)
4 – 20.0 kb Neb (小鼠nebuline蛋白)
M – GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder (#SM1331)
1 µg从Jukat细胞（1和 ）或者从小鼠（3和 4）中提取的总RNA在Maxima® Reverse transcriptase和其他逆转录酶的最佳反应条件时应用。合成的cDNA 在有Long PCR Enzyme Mix （#K0181）和不同基因的特定引物下作为PCR的模板：
1 – 6.8 kb POLE（人聚合酶）
2 – 9.4 kb FBN1（人原纤维蛋白1）
3 – 13.3 kb Dmd (小鼠 distrophine蛋白)
4 – 20.0 kb Neb (小鼠nebuline蛋白)
M – GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder (#SM1331)
图4。50°C时的高cDNA 合成率。
以1µg 的7kb RNA转录物为模板在15，30和60分钟合成33 P 标记的cDNA。反应产物在1%的碱性琼脂糖中解析。只有Maxima® RT 能够在5分钟内合成7 kb的转录物。
以1µg 的7kb RNA转录物为模板在15，30和60分钟合成33 P 标记的cDNA。反应产物在1%的碱性琼脂糖中解析。只有Maxima® RT 能够在5分钟内合成7 kb的转录物。
图5。采用Maxima® Reverse Transcriptase 的可重复性的R-qPCR结果。
100ng-1pg的总 Jurkat 细胞RNA，oligo(dT)18 和随机六聚体混合物，与Maxima® RT一起用于16个可以重复的反应中。合成的 cDNA在ABI 7500 Real-Time PCR仪上用作后续的的含有Maxima® SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (#K0221) 的qPCR 反应的模板。采用Maxima® RT的平行反应显示在宽范围的RNA起始量内呈现可重复的cDNA合成和低变化水平(<1% SD/Cq)。
100ng-1pg的总 Jurkat 细胞RNA，oligo(dT)18 和随机六聚体混合物，与Maxima® RT一起用于16个可以重复的反应中。合成的 cDNA在ABI 7500 Real-Time PCR仪上用作后续的的含有Maxima® SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (#K0221) 的qPCR 反应的模板。采用Maxima® RT的平行反应显示在宽范围的RNA起始量内呈现可重复的cDNA合成和低变化水平(<1% SD/Cq)。
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