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- 2025年07月15日
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蛋白定量
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美亿美生物
同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ) 技术由AB SCIEX公司研发的一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。
中文名：同位素标记相对和绝对定量
外文名：iTRAQ
性 质：蛋白质组学定量方法
原理
iTRAQ 技术采用4种或8种同位素编码的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，而后进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。
iTRAQ试剂是一种小分子同重元素化学物质，包括三部分：一端是报告部分reporter group，另一端是肽反应部分peptide reactive group，中间部分是平衡部分balance group。
以4标为例，其中：
1）reporter group：质量为114Da、115 Da、116 Da、117 Da。
2）peptide reactive group：将reporter group与肽N端及赖氨酸侧链连接，几乎可以标记样本中所有蛋白质。
3）balance group：质量为31 Da、30 Da、29 Da、28 Da，使得四种iTRAQ试剂分子量均为145 Da，即等量异位标签(isobaric tag)，保证iTRAQ标记的同一肽段m/z相同。将蛋白质裂解为肽段，然后用iTRAQ试剂进行差异标记。由于iTRAQ试剂是等量的，即不同同位素在标记同一多肽后在第一级质谱检测，分子量完全相同，用串联质谱方法对在第一级质谱检测到前体离子(precursor ion)进行碰撞诱导解离，产物离子通过第二级质谱进行分析。在二级质谱分析过程中，报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂，质量平衡基团丢失，产生低质荷比(m/z)的报告离子。由于二级质谱可分析相对分子质量相差1的报告基团，不同报告基团离子强度的差异就代表了它所标记的多肽的相对丰度。同时，多肽内的酰胺键断裂，形成一系列 b 离子和 y 离子，得到离子片段的质量数，通过数据库查询和比较，可以鉴定出相应的蛋白质前体。
技术特点
定量精确：每组平行比较多达8个样本，标记效率高达97%，可减少样本处理、以及不同组上机造成的实验误差。
高效率样品分离：进行SCX-HPLC分离，实现自动化操作。
高鉴定率：系统全面地研究组织或细胞中尽可能多的蛋白质，可鉴定多达6000种蛋白。
适用范围广：无物种特异性限制，理论上可用于所有物种。iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。
仪器性能优良：基于高分辨率（大于105）、高质量精度（小于1ppm）质谱平台，可获得更加准确的结果。iTRAQ技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。
实验流程
1.不同的蛋白质样品 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7 和 S8，首先分别进行蛋白酶水解（通常为胰蛋白酶Trypsin）；
2. 采用不同的标记对酶解片段进行标记后混合；
3. 使用液体色谱和质谱的联用进行一级质谱；
4. 8 个不同来源的，同一蛋白的同一个标记肽段在一级质谱上表现为一个峰；
5. 对加入标记的肽段进行二级质谱，同时，平衡基团从报告基团上脱落；
6. 二级质谱后，报告基团在二级质谱低质量区域产生8个报告离子信号：113、114、115、116、117、118、119 和 121，其强度分别代表 8 个标记的样品的同一个肽段；
7. 报告离子的峰面积比值就是同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值；
8. 对质谱仪所得的数据进行生物信息分析，定性和定量研究。
样品要求
1.蛋白运输：24小时内可以4℃运输；
2. 蛋白长期保存：-20℃；
3. 待检测蛋白要求：蛋白量最低50ug，浓度最低要 为5ug/ul 10ul，否则同位素无法标记；
4. 蛋白提取试剂要求：使用普通的组织、细胞裂解液即可，不要使用二维电泳试剂提取。
检测仪器
Q Exactive™ 组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪 使用 Thermo Scientific™ Q Exactive™ 组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪可以快速可靠地识别、定量和确认更多化合物。 本台式 LC-MS/MS 系统将四极杆母离子选择性与高分辨率和准确质量数（HRAM）Orbitrap 检测相结合，提供出色性能和多功能性。 Q Exactive 质谱仪特别适用于非目标或目标化合物筛查，也能够实现广泛的定性和定量应用，可广泛用于药物发现、蛋白质组学、环境和食品安全、临床研究和法医毒理学。
应用领域
非常高的通量，同时标记8个样品，一次实验实现多达8个样品的蛋白质鉴定和定量；
标记完全，标记效率高达97%以上可减少样本处理、以及不同组上机造成的实验误差；
可以进行多个时间点蛋白质组动态变化的监测；
可以分析详细分期/型的临床疾病样本，并可设计样本重复，甚至可以进行个体样本的研究；
可以研究细胞周期、细胞信号传导整个过程的蛋白质组动态学；
适用范围广：无物种特异性限制，理论上可用于所有物种。
疾病标志物筛选 作用机制研究
植物抗逆研究 药物作用靶点研究
特殊功能蛋白质筛选
iTRAQ技术区别与以往二维电泳技术具有更明显的优势，两者比较如下：
二维电泳所检测的发生表达变化的蛋白都位于细胞浆内，而iTRAQ可检测到蛋白有胞浆蛋白外，还有线粒体蛋白、膜蛋白和核蛋白；
二维电泳观察到的蛋白变化在2倍以上，而用iTRAQ计算出的蛋白变化在1.3-1.6倍之间；
iTRAQ技术在鉴定大分子和小分子蛋白方面也有优势；
二维电泳是通过切断条带，再用质谱方法测量条带中的蛋白质，但该方法既不是非常敏感，也不是非常精确，获取的信息量很少。 而itraq技术是基于高度敏感性和精确性的串联质谱方法，不需要凝胶，就可以获得相对和绝对定量的蛋白质结果；
iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白质和碱性蛋白质，而二维电泳对这些蛋白质都束手无策。 由此，邦菲生物得出结论：iTRAQ技术比二维电泳技术能发现更多数量和种类的蛋白，但在比较胞浆蛋白及蛋白量的变化方面，二维电泳技术有一定长处，对iTRAQ的实验结果有互补作用。
本推广资料的撰写参考了以下文献和网站资料，特此申明
参考资料
1. 同位素标记相对和绝对定量 ．.
2. 谢秀枝, 王欣*.iTRAQ技术及其在蛋白质组学中的应用[J] 中国生物化学与分子生物学报, 2011,V27(7): 616-621
3. iTRAQ技术 ．百度文库
4，http://www.thermoscientific.cn/p ... s-spectrometer.html
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