PCR一步定向克隆试剂盒（无缝克隆）

NovoRec® PCR一步定向克隆试剂盒(无缝克隆)是近岸蛋白质科技最新研发的专利产品。该产品可以不依赖于连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，而直接用同源 重组的方法，完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术。该技术操作简单，PCR产物一步定向克隆，目的片段与载体无缝连接，反应时间短至20分钟，阳性率 达到95%以上，让您轻松完成实验。

A.线性化载体的获得

线性化载体可以通过两种方法获得，不管采取哪种方法，最终线性化载体的 浓度需>15ng/μl。(高浓度的载体有利于提高效率)。
1、酶切选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可，并且5´端突出，3´端突出或平末端均适用本Kit。
2、PCR 选取合适的位点，设计正向和反向引物，引物长度一般在18-20bp 左右，一般载体长度均大于3kb，建议用高保真的聚合酶扩增（推荐使用 Novoprotein pfu DNA 聚合酶，货号：E002）。为了避免模板质粒DNA对后续 试验的影响，建议载体酶切后再用PCR扩增，自连背景更低，阳性率更高。

B.目的片段获得

目的片段通常通过PCR获得。引物设计要保证目的片段两端有至少15bp序列与 线性化载体的两端一致，特殊应用引物设计请参照技术手册。为保证PCR扩 增的特异性及灵敏度，请尽可能选用pfu等高保真酶（推荐使用Novoprotein pfu DNA聚合酶，货号：E002）。PCR每条引物长度至少在35-40bp，包括5´ 端与载体同源的15bp以及目的片段特异性序列20-25bp，（注意事项：如果是 表达载体克隆构建，引物设计完全后，请注意检查读码框的正确）。引物设 计方法：使用NovoRec®PCR一步定向克隆试剂盒（无缝克隆）时，引物设计是很重要的，在设计引物时同样要遵循引物设计的基本原则，只不过上下游引 物要加上15-18bp的载体同源序列。
载体同源序列如何添加主要分以下两种情况： (1)载体酶切后是5'端突出或平末端，则引物上的同源序列包括5'端突出部分的序列；（2）载体酶切后是3’端突出，则因无上的同源序列不包含突出部分。（如下图，红色碱基为希望保留原有的酶切位点所额外添加的碱基，不计算在15bp之内。

注：15bp同源序列不要求严格从载体最末端一届碱基计算，这是载体末端非同源序列将会被删除，同时导致重组效率的下降。当非同源序列达到20bp时，效率下降一半。

C.目的片段与载体的重组

1.将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比加到管子中 进行重组反应
2.混匀后在37℃放置20分钟;
3.立即进行转化，剩余连接液可保存在4℃或-20℃待用。（注意：1.目的片段与载体的摩尔比在3：1-10：1之间，摩尔比低于3：1效率会降低 2.反应时间在20-40分钟，时间太长不利于重组反应）

D.转化

建议所使用的感受态细胞效率要达到或>5X10⁶ cfu/μg.
1.冰上融化一管100 μl的DH5a感受态细胞，轻弹管壁使细 胞重悬起来。加入10μl的反应液到感受态细胞中，轻弹数下，置冰上孵育45分钟。
2.42℃水浴中热激90秒后快速放入冰上5分钟。
3.加入500μl SOC液体培养基，37℃孵育45-60分钟。
4.5k离心3分钟收集菌体，根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上。

E.阳性克隆鉴定

一般的，我们建议采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定(推荐使用Novoprotein 2x specificTM Master Mix 货号：E010)。
鉴定引物的选择：为避免假阳性结果，我们建议一条引物为载体特异性引物，另一条引物为目的片段特异性引物。