黄曲霉毒素B1酶联免疫反应试剂盒

黄曲霉毒素B1酶联免疫反应试剂盒
1．概述
黄曲霉毒素B1酶联免疫反应测试盒是用于检测谷类，饲料，肌肉，牛奶，花生和阿月浑子（开心果）中黄曲霉毒素B1的残留。该试剂盒特点包括：
高回收率（80-105%），快速（10-40分钟）。
高灵敏度（0.05ng/g或ppb）
高重现性。
快速的ELISA检测方法（在不考虑样品数量下只需不到2小时）。

黄曲霉毒素B1酶联免疫反应试剂盒2．试剂盒原理
黄曲霉毒素B1酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理，抗原已经包被于微孔板上。分析时，样品同一抗加入孔中，如果样品中含有毒素，会竞争抗体，因而抑制板上包被的毒素与抗体结合。HRP标记的二抗，与结合在板上一抗相结合后，加入TMB底物，底物的颜色显色强度与样品中毒素的含量成反比。
3.试剂盒组成
内容物 规格 保存
黄曲霉B1包被板(Aflatoxin B1Coated Plate) 96孔板（12×8 孔） 2-8℃
黄曲霉毒素B1标准品(Standards)：
0ng/ml阴性质控(Negative control)
0.05ng/ml
0.1ng/ml
0.2 ng/ml
0.4ng/ml
0.8 ng/ml
回收用100ng/ml(Spiking,可选)
1.0mL
1.0mL
1.0mL
1.0mL
1.0mL
1.0mL
1.0mL 2-8℃
黄曲霉毒素B1一抗(Aflatoxin B1 Antibody #1) 15mL 2-8℃
HRP-酶标二抗(HRP-Conjugated Antibody #2) 18mL 2-8℃
20×浓缩洗液(Wash Solution) 30mL
终止液(Stop Buffer) 20mL
TMB底物(Tmb Substrate) 10mL
本试剂盒应当在2-8℃的温度下储存，有效期为一年。如果一个月内不使用试剂盒，黄霉
素毒素B1标准品，一抗和1×HRP-二抗应置于-20℃或者冷冻保藏。
4.检测限
检测物质 检测下限（ng/g）
干肉/鱼，谷类，饲料，种子 1.0
肌肉/肝脏/肾脏 0.5
牛奶 0.5
花生酱 0.5
蔬菜/豆类/花生/橄榄油 2.5
5.交叉反应
药物 交叉反应率（%）
黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1) 100
黄曲霉毒素B2(Aflatoxin B2) 49
黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1) 45
黄曲霉毒素M2(Aflatoxin M2) 24
黄曲霉毒素G1(Aflatoxin G1) 37
黄曲霉毒素G2(Aflatoxin G2) 8
6．其他需要而本试剂盒未提的设备或材料
1)酶标仪(450nm)
2)恒温培养箱
3)匀质器
4)漩涡振荡器
5)微量加样器(10、20、100和1000L各一支)
6)多道枪：50-300L
7)甲醇

7.注意事项
实验前请阅读以下文字，以保证获得实验效果。
1)标准品中含有黄曲霉毒素B1，请小心使用。
2)不要使用过期的试剂盒。
3)不同批次的试剂盒不要混用，抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。确保二抗及二抗稀释液正确配制。
4)尽量保持室温20-25℃，避免在通风口操作防止温度过低，过热和/或者蒸发。同样的，不要在阳光直射下实验，防止过热及蒸发。在孵育期间，如果工作台温度过低，应该铺垫若干纸巾或者其他物料。
5)水质量很重要，确保使用蒸馏或者去离子水。
6)加入样品或者试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接触。
7)孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品。
8)从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准品曲线质量的风险。
9)将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。

黄曲霉毒素B1酶联免疫反应试剂盒8．样品的准备
样品保存在2-4℃不超过1-2天，如果需要保存较长的时间，应该放置-20℃。样品使用前应恢复到室温。
1） 干肉/鱼，谷类，饲料，种子
（1）研磨并混匀适量的样品；
（2）称取5g磨碎的样品，放入适当的容器中；
（3）加入25mL70%甲醇，用手或者振荡器剧烈振荡20分钟；
（4）室温（22.5±2.5）°C下4000 rpm离心10分钟；
（5）取1mL上清液，加入1mL蒸馏水或者去离子水稀释；
（6）取50μL作检测。
稀释倍数：10
备注：如果需要，样品所取的量可以增加，同时甲醇/水的用量也必须作相应的改变。例如取10g样品，应该加入50mL70%甲醇。如果样品中黄曲霉毒素含量很高，那么样品必须经过稀释，请用35%甲醇进行稀释。
2）肌肉/肝脏/肾脏
（1）研磨并混匀适量的样品；
（2）称取5g磨碎的样品，放入适当的容器中；
（3）加入25mL70%甲醇，用手或者振荡器剧烈振荡20分钟；
（4）室温（22.5±2.5）°C下4000 rpm离心10分钟；
（5）取1mL上清液，加入1mL蒸馏水或者去离子水稀释；
（6）取50μL作检测。
稀释倍数：10
备注：如果需要，样品所取的量可以增加，同时甲醇/水的用量也必须作相应的改变。例如取10g样品，应该加入50mL70%甲醇。如果样品中黄曲霉毒素含量很高，那么样品必须经过稀释，请用35%甲醇进行稀释。
3）花生酱
（1） 研磨并混匀适量的样品
（2） 称取2g匀质的样品，放入适当的容器中
（3） 加入4mL35%甲醇，用手或者振荡器剧烈振荡20分钟
（4） 室温（22.5±2.5）°C下4000 rpm离心10分钟
（5） 取50μL作检测
稀释倍数：3
4）牛奶
（1）.脱脂牛奶：用35%甲醇按1：9的比例稀释牛奶样品（20ul牛奶+180ul35%甲醇），取50ul稀释样品以待检测
（2）.含脂牛奶：取适量样品，室温（22.5±2.5）°C4000g离心5min，弃去上层脂肪层，用35%甲醇按1：9的比例稀释牛奶样品（20ul牛奶+180ul35%甲醇），取50ul稀释样品以待检测
稀释倍数：10
5）蔬菜/豆类/花生/橄榄油
（1） 称取0.5g样品，加入2.5ml35%的甲醇。
（2） 涡流10分钟或高速涡流3分钟,静置2分钟
（3） 去掉上层脂肪液，取50μL下清液作检测
稀释倍数：5

9．酶联免疫反应测试步骤
试剂准备

注意：试剂在使用之前要在室温下解冻1-2小时，确定在使用前阅读过注意事项。准备适量的检测用试剂，所有的试剂摇匀后使用。准备足够所有小管所需的用量，不能将试剂倒回原来的瓶子中，处理试剂时建议用废弃的瓶子以降低污染的风险。
1x洗液的制备
1体积的20x洗液同19体积的蒸馏水混合
检测

以下为计算份量的表格，用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。
试剂 每个反应需要的体积 24次反应的体积
一抗 100 L 2.4mL
二抗工作液 150 L 3.6mL
工作洗液 2 mL 48 mL
终止液 100 L 2.4 mL
底物 100 L 2.4 mL
（1）加入50L的标准液于所设定的孔中；
（2）加入50L的样品于所设定的孔中
（3）在每孔中加入100L一抗， 轻敲微孔板边缘混匀60秒；
（4）室温（22.5±2.5）°C避光孵育30分钟
洗板3次，每次加入250L 1×洗液，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干；
（5）每孔加入150L 1×二抗工作液，室温（22.5±2.5）°C避光孵育30分钟
洗板3次，每次加入250L 1×洗液，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干；
（6）每孔加入100L的TMB底物，用手敲板边缘1分钟混合均匀；
（7） 室温（22.5±2.5）°C避光孵育15分钟， 加入100L的终止液终止反应。
（8） 在450nm下读OD值(读数前，用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕)。

10．结果计算
（1）分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。
（2）相对吸光度值 (%) = (标准或样品吸光度值/零标准吸光度值) 100
（3）以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度为横坐标建立标准曲线。

（4）从标准曲线上读取质控和样品的浓度值。
（5）样品检测下限和定量下限计算方法如下：
样品检测下限 = (0.05ng/g) (稀释倍数)
样品定量下限 = (0.1ng/g) (稀释倍数)

黄曲霉毒素B1酶联免疫反应试剂盒

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备注：如结果呈阳性反应，应该用其他检验方法（如色谱/质谱方法等）进行确证。
以下曲线图是黄曲霉毒素B1酶联免疫反应测试盒的典型标准曲线