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- KL299Mu02
- 2025年07月15日
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- 保质期：
6-12months
- 英文名：
Recombinant Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4)
- 库存：
大量
- 供应商：
康朗生物
- 规格：
50ug/100ug/1mg
www.shklbio.com
1.基因扩增
（1）引物合成
搜索目标蛋白基因信息，结合蛋白的结构信息，选取片段或全长设计引物。注意避开跨膜区，以及复杂的二级结构，优选N端或C端，引物评分尽可能高，并搜索出核酸序列的酶切位点，使用载体等信息。经研发部根据研发经验提出修改意见最终定稿后交由第三方公司进行引物合成。
（2）基因克隆机重组鉴定
1）PCR
根据目的蛋白特异性表达组织，选取特异组织RNA用上述引物进行PCR扩增。进行琼脂糖凝胶电泳后，根据分子量大小选取目标片段进行切胶回收。再次PCR扩增，获得大量DNA，并进行PCR产物回收。
2）酶切，连接
根据酶切位点，将目标PCR产物以及相应载体进行酶切，获得粘性末端的DNA产物后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应片段切胶回收。并将具有相同酶切位点的载体与DNA片段进行连接
3）转化，挑菌验证
将连接好的目的片段转化感受态E.coli,并在LB平板上进行过夜培养。挑取平板上的菌斑进行验证PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应菌液进行测序，测序正确后留种保存。
2.蛋白表达
（1）蛋白表达小试
挑取少量菌种进行培养，并诱导表达，将表达的蛋白进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达，小试表达成功后将进行蛋白预放大实验
（2）蛋白放大实验
将小试表达成功的蛋白菌株用400-800 ml培养基进行培养表达，进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达成功，预放大实验成功后将进行进一步的蛋白放大实验，放大实验使用800-1600 ml培养基进行培养，具体验证同上。
3.蛋白纯化
由于载体中包含了his标签，故采用镍柱进行纯化。有些蛋白可能会形成包涵体，在之前的一篇专题中我们有详细介绍过大肠杆菌重组蛋白纯化方法,纯化后的蛋白会进行SDS-PAGE， BCA等实验分子量以及纯度进行验证，纯度超过95%。
4. 质量检测
获得蛋白后会进行冻干，冻干之后会进行常规蛋白实验进行验证，合格后保存。
重组蛋白的制备主要是依据以上原理及步骤。以上是以原核表达举例。在制备过程中每一个环节都至关重要，不同的蛋白会在不同的环节出现技术难点，包括目的基因的扩增，包涵体的形成都会对重组蛋白的研发造成困境。但Cloud Clone Corp. 具有多年研发经验，还可提供真核表达系统，哺乳动物细胞表达系统，用户可根据需要选择，同时对蛋白有特殊要求我们也可提供私人定制。
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文献和实验体内基因 表达模式方面的研究。在药物研发领域，科学家通过可发光转基因动物（例如：大鼠或小鼠基因组中整合了修饰的内源基因和BL报告基因）作为人类疾病的模式动物进行目标确认的研究。 例如：目前已经建立了一个转基因小鼠模型，可以监测编码人细胞色素P450 3A4（CYP3A4）基因的体内转录调控，人细胞色素P450 3A4在药物代谢方面起着重要作用。 传染性疾病 疾病的进程和治疗剂的功效可以通过对小鼠注射BL标记进行评估。例如注射经过修饰的病原微生物，然后对透过动物组织的光进行
作用等方面具有重要意义。 1.3 CYP450酶及代谢表型研究方法 CYP450为一类含亚铁血红素蛋白的超家族，根据相关酶亚型在药物代谢中的重要程度，可将CYP450分为以下三类：（1）主要CYP450，包括CYP1A2、CYP2C9 、CYP2C19 、CYP2D6 和CYP3A4；（2）较主要CYP450，包括CYP2B6、CYP2C8和CYP3A5；（3）次要CYP450，包括CYP1A1、CYP1B1、CYP2A6、CYP2E1、CYP2J2和CYP4A11等。参与药物代谢的动物肝微粒
肝细胞的标志——醛缩酶 B mRNA 的水平，达到新鲜分离的人肝细胞 20% 的水平。相比 HepaG2 细胞，其白蛋白和触珠蛋白 mRNA 的表达水平比 HepaRG 细胞低，检测不到醛缩酶 B 的转录。二、药物代谢相关酶系细胞色素 P450（CYP）是最大的药物代谢酶蛋白超家族之一，其中参与人体肝药物代谢的主要有 CYP1、CYP2、CYP3 及 CYP4 家族。P450 酶易受多种内外源性物质的诱导或抑制，导致酶数量和活性改变，从而改变药代动力学，使药物活性物质累积导致毒性增强或降低其血
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