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- 2025年07月15日
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6-12months
- 英文名：
Recombinant Glutathione Peroxidase 4 (GPX4)
- 库存：
大量
- 供应商：
康朗生物
- 规格：
50ug/100ug/1mg
www.shklbio.com
1.基因扩增
（1）引物合成
搜索目标蛋白基因信息，结合蛋白的结构信息，选取片段或全长设计引物。注意避开跨膜区，以及复杂的二级结构，优选N端或C端，引物评分尽可能高，并搜索出核酸序列的酶切位点，使用载体等信息。经研发部根据研发经验提出修改意见最终定稿后交由第三方公司进行引物合成。
（2）基因克隆机重组鉴定
1）PCR
根据目的蛋白特异性表达组织，选取特异组织RNA用上述引物进行PCR扩增。进行琼脂糖凝胶电泳后，根据分子量大小选取目标片段进行切胶回收。再次PCR扩增，获得大量DNA，并进行PCR产物回收。
2）酶切，连接
根据酶切位点，将目标PCR产物以及相应载体进行酶切，获得粘性末端的DNA产物后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应片段切胶回收。并将具有相同酶切位点的载体与DNA片段进行连接
3）转化，挑菌验证
将连接好的目的片段转化感受态E.coli,并在LB平板上进行过夜培养。挑取平板上的菌斑进行验证PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应菌液进行测序，测序正确后留种保存。
2.蛋白表达
（1）蛋白表达小试
挑取少量菌种进行培养，并诱导表达，将表达的蛋白进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达，小试表达成功后将进行蛋白预放大实验
（2）蛋白放大实验
将小试表达成功的蛋白菌株用400-800 ml培养基进行培养表达，进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达成功，预放大实验成功后将进行进一步的蛋白放大实验，放大实验使用800-1600 ml培养基进行培养，具体验证同上。
3.蛋白纯化
由于载体中包含了his标签，故采用镍柱进行纯化。有些蛋白可能会形成包涵体，在之前的一篇专题中我们有详细介绍过大肠杆菌重组蛋白纯化方法,纯化后的蛋白会进行SDS-PAGE， BCA等实验分子量以及纯度进行验证，纯度超过95%。
4. 质量检测
获得蛋白后会进行冻干，冻干之后会进行常规蛋白实验进行验证，合格后保存。
重组蛋白的制备主要是依据以上原理及步骤。以上是以原核表达举例。在制备过程中每一个环节都至关重要，不同的蛋白会在不同的环节出现技术难点，包括目的基因的扩增，包涵体的形成都会对重组蛋白的研发造成困境。但Cloud Clone Corp. 具有多年研发经验，还可提供真核表达系统，哺乳动物细胞表达系统，用户可根据需要选择，同时对蛋白有特殊要求我们也可提供私人定制。
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文献和实验重大突破！甘波谊团队 Nature 首次报道第三种铁死亡抑制机制，提供抗癌新思路
细胞死亡与癌症等疾病有着密切关系，在细胞的各式花样死法中，铁死亡（ferroptosis）作为一种新兴的死亡方式，近年来越来越受到大家的关注。图片来源：站酷海洛 Plus铁死亡是一种由脂质过氧化引起的细胞死亡方式，是抑制肿瘤生长的关键机制之一。先前的研究发现细胞至少进化出两种防御机制来抑制铁死亡的发生：1) 谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）利用还原性谷胱甘肽（GSH）消除脂质过氧化物并抑制铁死亡；2) FSP1（也称为 AIFM2）作为一种氧化还原酶，主要在质膜上将 CoQ 还原
4. 氧化还原以促使二硫键的形成 为促使蛋白的二硫键的正确形成，可以在透析液中加入氧化剂和还原剂继续透析，经常用的氧化还原剂为氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽，比较经济的方法是使用 CuSO4 或 NaSeO3 ,但使用这种方法所形成的不正确的二硫键比前者高。因此本论文中使用氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽。 1) 如上制备透析液，但加入氧化还原剂，于4℃保存（其中还原性谷胱甘肽和氧化性谷胱甘肽的浓度
后继的亲和纯化。目前最为流行的融合标签自然是 His-Tag，和 GST，来自 G-Biosciences 等公司都有质量非常稳定可靠的产品，种类还特别丰富，分别对应不同的上样量和工作压力和流速的需要。笔者在这里介绍一下江湖中盛传的 Tag 蛋白纯化的「刀剑笑」，目的就是为在产品选择上帮你省点事...... 「横刀」-蛋白亲和纯化 GST 树脂 G-Biosciences 的谷胱甘肽树脂，用于分离 GST 重组蛋白 用来亲和纯化带有 GST 标签的蛋白。树脂由还原性的谷胱甘肽通过 10
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