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- KL900Hu013
- 2025年10月21日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
6-12months
- 英文名：
Recombinant Deoxyhypusine Synthase (DHPS)
- 库存：
大量
- 供应商：
康朗生物
- 规格：
50ug/100ug/1mg
www.shklbio.com
应用重组DNA将目标基因进行表达得到的蛋白质成为重组蛋白，重组蛋白在生物信号传导过程，药物研发，科学研究中扮演着重要角色。下面来介绍一下重组蛋白的生产工艺流程。
1.基因扩增
（1）引物合成
搜索目标蛋白基因信息，结合蛋白的结构信息，选取片段或全长设计引物。注意避开跨膜区，以及复杂的二级结构，优选N端或C端，引物评分尽可能高，并搜索出核酸序列的酶切位点，使用载体等信息。经研发部根据研发经验提出修改意见最终定稿后交由第三方公司进行引物合成。
（2）基因克隆机重组鉴定
1）PCR
根据目的蛋白特异性表达组织，选取特异组织RNA用上述引物进行PCR扩增。进行琼脂糖凝胶电泳后，根据分子量大小选取目标片段进行切胶回收。再次PCR扩增，获得大量DNA，并进行PCR产物回收。
2）酶切，连接
根据酶切位点，将目标PCR产物以及相应载体进行酶切，获得粘性末端的DNA产物后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应片段切胶回收。并将具有相同酶切位点的载体与DNA片段进行连接
3）转化，挑菌验证
将连接好的目的片段转化感受态E.coli,并在LB平板上进行过夜培养。挑取平板上的菌斑进行验证PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应菌液进行测序，测序正确后留种保存。
2.蛋白表达
（1）蛋白表达小试
挑取少量菌种进行培养，并诱导表达，将表达的蛋白进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达，小试表达成功后将进行蛋白预放大实验
（2）蛋白放大实验
将小试表达成功的蛋白菌株用400-800 ml培养基进行培养表达，进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达成功，预放大实验成功后将进行进一步的蛋白放大实验，放大实验使用800-1600 ml培养基进行培养，具体验证同上。
3.蛋白纯化
由于载体中包含了his标签，故采用镍柱进行纯化。有些蛋白可能会形成包涵体，在之前的一篇专题中我们有详细介绍过大肠杆菌重组蛋白纯化方法,纯化后的蛋白会进行SDS-PAGE， BCA等实验分子量以及纯度进行验证，纯度超过95%。
4. 质量检测
获得蛋白后会进行冻干，冻干之后会进行常规蛋白实验进行验证，合格后保存。
重组蛋白的制备主要是依据以上原理及步骤。以上是以原核表达举例。在制备过程中每一个环节都至关重要，不同的蛋白会在不同的环节出现技术难点，包括目的基因的扩增，包涵体的形成都会对重组蛋白的研发造成困境。但Cloud Clone Corp. 具有多年研发经验，还可提供真核表达系统，哺乳动物细胞表达系统，用户可根据需要选择，同时对蛋白有特殊要求我们也可提供私人定制。
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文献和实验牢记N端法则：当N端第二个残基是Leu、Arg、Lys、Phe、Tyr和Trp时，重组蛋白半衰期只有2分钟，而小侧链的氨基酸残基，如Ala，则可以提高蛋白稳定性。因此在设计载体时，要特别注意第二个密码子，避免上述残基的出现。处理高毒性蛋白：毒性极高的重组蛋白，其本底表达就会杀死原核宿主，质粒容易丢失，使其在大肠杆菌中很难得到高表达。采用可表达T7溶菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制剂，采用含有T7溶菌酶质粒的宿主，如pLysS，可以降低重组蛋白在大肠杆菌快速生长期的本底
X-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）洗涤除去脂类和膜蛋白，这一步很重要，否则会导致包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解[6、7、8]。 包涵体的溶解必须用很强的变性剂，如8mol/L尿素、6~8mol/L盐酸胍，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，异氰盐酸胍最强；去污剂，如SDS[7]，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸，如70%甲酸[9]，可以破坏蛋白
杆菌的包涵体可采用离心收获。 洗涤 包涵体常用的洗涤试剂为中性去垢剂和还原剂。包涵体中主要由重组蛋白组成，同时也含有一些外膜蛋白（Omp C、Omp F、Omp A）、16S 和 23S、5S的r RNA、质粒 DNA 和其它杂质。去除这些杂质，可采用去垢剂 Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂等对包涵体充分洗涤。包涵体洗涤的洁净程度，对于后续的纯化步骤十分重要，包涵体纯度高，可以大大降低后续的纯化压力。但是，变性剂尿素的使用应该注意的是大肠杆菌外膜蛋白Omp T（37 kD
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