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- KALANG/进口品牌
- 中国/美国
- KL732Hu01
- 2025年10月22日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
6-12months
- 英文名：
Recombinant Protein O-Mannosyltransferase 1 (POMT1)
- 库存：
大量
- 供应商：
康朗生物
- 规格：
50ug/100ug/1mg
www.shklbio.com
1.基因扩增
（1）引物合成
搜索目标蛋白基因信息，结合蛋白的结构信息，选取片段或全长设计引物。注意避开跨膜区，以及复杂的二级结构，优选N端或C端，引物评分尽可能高，并搜索出核酸序列的酶切位点，使用载体等信息。经研发部根据研发经验提出修改意见最终定稿后交由第三方公司进行引物合成。
（2）基因克隆机重组鉴定
1）PCR
根据目的蛋白特异性表达组织，选取特异组织RNA用上述引物进行PCR扩增。进行琼脂糖凝胶电泳后，根据分子量大小选取目标片段进行切胶回收。再次PCR扩增，获得大量DNA，并进行PCR产物回收。
2）酶切，连接
根据酶切位点，将目标PCR产物以及相应载体进行酶切，获得粘性末端的DNA产物后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应片段切胶回收。并将具有相同酶切位点的载体与DNA片段进行连接
3）转化，挑菌验证
将连接好的目的片段转化感受态E.coli,并在LB平板上进行过夜培养。挑取平板上的菌斑进行验证PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应菌液进行测序，测序正确后留种保存。
2.蛋白表达
（1）蛋白表达小试
挑取少量菌种进行培养，并诱导表达，将表达的蛋白进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达，小试表达成功后将进行蛋白预放大实验
（2）蛋白放大实验
将小试表达成功的蛋白菌株用400-800 ml培养基进行培养表达，进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达成功，预放大实验成功后将进行进一步的蛋白放大实验，放大实验使用800-1600 ml培养基进行培养，具体验证同上。
3.蛋白纯化
由于载体中包含了his标签，故采用镍柱进行纯化。有些蛋白可能会形成包涵体，在之前的一篇专题中我们有详细介绍过大肠杆菌重组蛋白纯化方法,纯化后的蛋白会进行SDS-PAGE， BCA等实验分子量以及纯度进行验证，纯度超过95%。
4. 质量检测
获得蛋白后会进行冻干，冻干之后会进行常规蛋白实验进行验证，合格后保存。
重组蛋白的制备主要是依据以上原理及步骤。以上是以原核表达举例。在制备过程中每一个环节都至关重要，不同的蛋白会在不同的环节出现技术难点，包括目的基因的扩增，包涵体的形成都会对重组蛋白的研发造成困境。但Cloud Clone Corp. 具有多年研发经验，还可提供真核表达系统，哺乳动物细胞表达系统，用户可根据需要选择，同时对蛋白有特殊要求我们也可提供私人定制。
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文献和实验the reconstituted vial to sit at 4oC for at > 2 hours before use. (将重悬液在4oC静置2小时以上) 3. This solution can be stored at 2-8oC for up to 1 week. 第 3 步：该重悬液在 2-8oC 最长可保存 1 周。 用说明书上推荐的溶液将细胞因子或重组蛋白重悬到推荐的浓度后，细胞因子或重组蛋白可放置在2-8o C，即冰箱的冷藏室。在这种条件下，细胞因子或重组蛋白的活性
-lauroylsarcosine 这一步一般来说是非必需的。因为实验室中检测发现经过透析后样品中N-lauroylsarcosine 的水平只相当于溶解液中的 1%，不超过 0.003%。因此一般在用阴离子交换树脂处理之前先检测样品中的 N-lauroylsarcosine 水平。并且使用此方法还要确信目的蛋白在实验过程中不会和阴离子交换树脂结合。 1) 准备阴离子交换树脂，依次以浓度为 1 M 的 NaOH、ddH2 O、4M的乙酸、ddH2 O、50 mM
重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量 按Qiagen公司的操作手册进行，具体步骤如下。 一、重组蛋白质的诱导表达 1.挑取转化有质粒的单菌落，接种于3ml 选择性LB液体培养基中，37 o C，250 rpm/min振摇培养过夜。 2.次日将培养过夜的菌液500 μl再接种于10 ml（1: 20）选择性LB液体培养基中，37 o C，250 rpm/min振摇培养至光密度（OD600 =0.6）时，取1 ml样本作为诱导前标本
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