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- KL460Mu01
- 2025年08月20日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
6-12months
- 英文名：
Recombinant Mitogen Activated Protein Kinase Activated Protein Kinase 2 (MAPKAPK2)
- 库存：
大量
- 供应商：
康朗生物
- 规格：
50ug/100ug/1mg
www.shklbio.com
1.基因扩增
（1）引物合成
搜索目标蛋白基因信息，结合蛋白的结构信息，选取片段或全长设计引物。注意避开跨膜区，以及复杂的二级结构，优选N端或C端，引物评分尽可能高，并搜索出核酸序列的酶切位点，使用载体等信息。经研发部根据研发经验提出修改意见最终定稿后交由第三方公司进行引物合成。
（2）基因克隆机重组鉴定
1）PCR
根据目的蛋白特异性表达组织，选取特异组织RNA用上述引物进行PCR扩增。进行琼脂糖凝胶电泳后，根据分子量大小选取目标片段进行切胶回收。再次PCR扩增，获得大量DNA，并进行PCR产物回收。
2）酶切，连接
根据酶切位点，将目标PCR产物以及相应载体进行酶切，获得粘性末端的DNA产物后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应片段切胶回收。并将具有相同酶切位点的载体与DNA片段进行连接
3）转化，挑菌验证
将连接好的目的片段转化感受态E.coli,并在LB平板上进行过夜培养。挑取平板上的菌斑进行验证PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应菌液进行测序，测序正确后留种保存。
2.蛋白表达
（1）蛋白表达小试
挑取少量菌种进行培养，并诱导表达，将表达的蛋白进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达，小试表达成功后将进行蛋白预放大实验
（2）蛋白放大实验
将小试表达成功的蛋白菌株用400-800 ml培养基进行培养表达，进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达成功，预放大实验成功后将进行进一步的蛋白放大实验，放大实验使用800-1600 ml培养基进行培养，具体验证同上。
3.蛋白纯化
由于载体中包含了his标签，故采用镍柱进行纯化。有些蛋白可能会形成包涵体，在之前的一篇专题中我们有详细介绍过大肠杆菌重组蛋白纯化方法,纯化后的蛋白会进行SDS-PAGE， BCA等实验分子量以及纯度进行验证，纯度超过95%。
4. 质量检测
获得蛋白后会进行冻干，冻干之后会进行常规蛋白实验进行验证，合格后保存。
重组蛋白的制备主要是依据以上原理及步骤。以上是以原核表达举例。在制备过程中每一个环节都至关重要，不同的蛋白会在不同的环节出现技术难点，包括目的基因的扩增，包涵体的形成都会对重组蛋白的研发造成困境。但Cloud Clone Corp. 具有多年研发经验，还可提供真核表达系统，哺乳动物细胞表达系统，用户可根据需要选择，同时对蛋白有特殊要求我们也可提供私人定制。
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文献和实验质芯片检测。此外，肽芯片或基于质谱的方法[ 20，21] 也可以用于这方面。 我们在此介绍基于蛋白质芯片技术的蛋白磷酸化筛选方法和高通量确定蛋白激酶底物的方法。我们已成功地用这种筛选工具鉴定大麦酪蛋白激酶 2α ( CK 2α) 和不同的拟南芥丝裂原活化蛋白（MAP) 激酶 [23] 的新靶标。我们这个方法使用本书第 28 章详细描述的植物蛋白质芯片（见第 28 章）。在放射性【 γ33 磷】三磷酸腺苷存在的条件下，用可溶和具有活性的激酶孵育芯片。通过磷屏成像仪或 X 射线胶片检测到的放射性信号，对可能
信号通路研究工具 促细胞分裂原活化蛋白激酶(MAP kinase)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由于不同的细胞外刺激或介导细胞表面至细胞核的信号转导而被激活。 结合其它信号途径，它们能够改变转录因子的磷酸化状态。受控的MAPK级联反应系统参与细胞增殖和分化，但当其活力失控时会导致肿瘤。 据报道，三种主要的MAPK级联反应类型在哺乳动物细胞中与不同的上游信号协同反应。现今研究最广泛的级联反应系统是ERK1/ERK2 MAPK。一般激活的过程包括受体酪氨酸激酶
以及关闭宿主蛋白合成的功能。研究发现，一些E4产物可以与DNA激活的蛋白激酶结合，防止病毒DNA发生串联。由于该激酶可以激活p53基因，因此可以认为一些E4区基因产物可以抑制细胞凋亡。许多E1B和E4基因产物都与拮抗E1A蛋白功能有关。比如，E4 orf4抑制E1A对E2F启动子的激活；E4 orf3 VA RNA 使一些由腺病毒转录的非翻译RNA，与腺病毒抵抗宿主细胞免疫有关。 二. 重组腺病毒载体 （一） 构建重组腺病毒载体的目的 1. 增加外源基因的装载容量 我们知道，腺病
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