RNA分离与纯化
包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料,mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品,RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。RNA中rRNA的数量最多,占总量的80%~85%;tRNA及核内小分子RNA占15%~20%;mRNA仅占1%~5%。由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚,从基因克隆、表达与诊断的目的出发,目前对RNA的分离与纯化,主要集中在总RNA与mRNA上。
总RNA的分离与纯化
由于RNase的影响,为获得完整的RNA分子,就必须在总RNA分离纯化的最初阶段,尽可能快地灭活胞内RNase的活性。在β-巯基乙醇的协同作用下,高浓度的(异)硫氰酸胍可以极大极快地抑制RNase的活性,能从胰腺等富含RNase的组织细胞中分离出完整的RNA分子,目前已成为常规使用的试剂。pH8.0的Tris饱和酚用于DNA的制备,但在RNA纯化时,应使用pH4.5~5.5的水饱和酸性酚,这既有利于DNA的变性又有利于RNA的分离。尽管对剪切力不敏感,但RNA具有碱易变性,需要严格控制pH值。另外,在DNA与RNA的提取过程中,酚与氯仿经常结合、交替使用,主要在于两者合用时去除蛋白的效果更好,而且氯仿还能有效抑制RNase的活性,通过使酚脱水防止mRNA的丢失,加速有机相与水相的分层,去除植物色素和蔗糖以及核酸样品中的痕量酚。少量异戊醇的加入,其目的在于消除抽提过程中因蛋白质变性而产生的泡沫。由于高浓度胍类的使用,为防止SDS的沉淀,常改用十二烷基肌氨酸钠。对含量较低的样品,加入糖原可以提高RNA的回收率。
mRNA的分离与纯化
模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染,因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换(使用一次性手套)。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。
与大小和序列明确的rRNA、tRNA及核内小分子RNA不同,真核生物的mRNA在细胞中含量少、种类多、分子量大小不一。除血红蛋白及某些组蛋白外,绝大多数mRNA在其3'末端带有一个长短不一的多聚腺苷酸(polyadenylic acid)的结构,即poly(A)尾巴。以总RNA制品为起始材料,利用核酸的碱基配对原理,通过oligo(dT)-纤维素或poly(U)-琼脂糖凝胶的亲和层析,可以很容易地同时分离不同种类与大小的mRNA的分子群体。理论上,它们可编码细胞内所有的蛋白质与多肽分子。