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- 2025年12月23日
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- 组织来源：
乳腺
- 物种来源：
人
- 是否是肿瘤细胞：
是
1. 先从外包装盒拿出细胞瓶，在细胞瓶表面喷一层酒精，并小心去掉封口膜；
2. 在显微镜下观察细胞状态，并确定是否染菌，如有染菌，请立即拍照，并将细胞丢掉；
3. 将培养瓶置于 37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养 4-6 小时；
4. 倒掉多余的培养基，留正常体积的培养基；
5. 重新将培养瓶置于 37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养过夜
6. 第二天传代。
收到冻存细胞的处理方法：
1.37°C 水浴预热培养基；
2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C 水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；
3.在超净台中加入5ml 培养基重悬细胞，1000rpm 离心5min；
4.弃上清，加入5ml 培养基重悬细胞后转入 T25培养瓶中，轻轻晃匀；
5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话，瓶盖不要拧太紧)；
6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。
细胞传代
1.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；
2.37°C 水浴预热培养基；
3.在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS 清洗细胞后，再加入1ml 胰酶消化细胞；
4.显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml 培养基终止消化；
5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散；
6.将细胞移入离心管中，1000rpm 离心5min；
7.弃上清，加入15-20ml 的培养基重悬细胞后转入 T75培养瓶中或按适当比例传到 T25瓶中（确保细胞贴壁
后融合度在25-50%之间），细胞密度在1×104cells/cm2(2.5×105cells/T-25瓶），混匀细胞悬液，确保均
匀分布；
8.将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养。
细胞冻存
1.37°C 水浴预热培养基；
2.消化细胞后给细胞计数:
1)洗净晾干血小板计数板和盖玻片，将盖玻片完全覆盖计数区；
2)充分混匀细胞，取少量(0.1-0.5ml)细胞悬液与等体积的染色液台盼蓝混合，移液器吹吸混合均匀，用移液
器取20ul 混合液从盖玻片两端(与中间凹槽平行的两端)分别打入细胞，以细胞悬液刚好浸湿盖玻片为佳；
3)显微镜下，数四个计数区的总细胞数，无活性细胞染成蓝色，活细胞不被染色；
4)细胞密度=细胞总数/4×10000×2；
这里10000是不变的，因为计数的细胞是在体积为1mm×1mm×0.1mm 即10-4cm3计数池内，1cm3=1ml，将
四个计数区的细胞数除以4取平均数，乘2是补偿加等体积台盼蓝形成的稀释。
5)细胞活性=活细胞数/细胞总数×100%。
注:细胞密度高时，可调整细胞悬液和台盼蓝的比例，计数时乘以相应的稀释倍数即可。
3.当细胞密度达到传代密度且细胞活性在90%以上时，可以冻存细胞。
4.在超净台中将要冻存的细胞移入离心管，1000rpm 离心5min。
5.弃上清，用90%培养液+10%DMSO 的混合液重悬细胞，并调整细胞密度为1-3×106/ml。
6.将细胞悬液分装到冻存管中(1-1.5ml/管)。
7.将装有细胞的冻存管放入程序降温冻存盒，-20°C 放1-2h 后，-80°C 过夜，然后快速转移到液氮中。
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