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- 2025年09月06日
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Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal
- 英文名：
Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal
- 库存：
Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal
- 供应商：
研卉生物
- 规格：
5assays (35mm dish)
细胞衰老检测试剂盒 - SPiDER-βGal
特点：
● 活细胞和固定细胞均可染色
● 可用共聚焦显微镜或流式细胞仪检测
● 可固定后与抗体共染色
常见问题Q&A
| Q1: 本试剂盒的大概可以检测多少次？ |
| A1:大概的检测次数，请参考下表中不同的使用容器： |
| 35mm dish | Micro Plate | Chamber Slide | |
| 使用次数 | 5 dishes | 2 plates | 7 slides |
| *使用次数会随着每孔添加的染色溶液量的变化而变化。使用前请先确认每孔的必要的染色溶液量。 |
| Q2: 为什么要添加Bafilomycin A1？ |
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A2：很多细胞内部都存在内源性β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase)，由于SPiDER-βGal与内源性β-半乳糖苷酶和细胞衰老的标记物SA-β-Gal都会发生反应。即使在没有衰老的细胞中，背景也较高，妨碍了SA-β-Gal的检测。 Bafilomycin A1可以抑制溶酶体中的ATPase活性，并将溶酶体中的pH从酸性变为接近中性，从而降低了内源性β-半乳糖苷酶的活性。因此，在添加SPiDER-βGal之前先用Bafilomycin A1处理细胞，使得SPiDER-βGal可以与SA-β-gal反应，并对衰老细胞进行荧光染色。 下图显示了添加和不添加Bafilomycin A1时检测SA-β-gal的差异。 由于Bafilomycin A1也被用作自噬的抑制剂。使用时，请考虑是否会对实验体系有影响，如果有影响，建议固定细胞。细胞固定时，缓冲液会控制细胞内的pH，所以不需要使用Bafilomycin A1。可以参照操作说明书中的步骤进行染色。
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| Q3: DMSO stock solution 可以稳定保存多久？ |
| A3: SPiDER-βGal DMSO stock solution和Bafilomycin A1 DMSO stock solution配制后，-20℃可以稳定保存1个月。 |
| Q4: Working solution可以稳定保存多久？ |
| A4: SPiDER-βGal working solution和Bafilomycin A1 working solution无法长期保存，请现配现用。 |
| Q5: 做细胞衰老的荧光观察时有哪些注意事项？ |
| A5: 随着细胞的衰老，被称为脂褐素(Lipofuscin)的不溶性物质会在细胞中积聚。 脂褐素自身会产生荧光，进而增加荧光背景。 在这种情况下，我们建议您准备不含SPiDER-βGal的样品，以准确评估衰老细胞中的SA-β-gal活性。 流式细胞仪检测 ・测定“衰老细胞”和“正常细胞”的平均荧光强度（MFI） ①添加了SPiDER-βGal的细胞 ②未添加SPiDER-βGal的细胞 (背景) ・“①的平均荧光强度”减去“②的平均荧光强度” 用扣除背景后的SA-β-gal的荧光来表征SA-β-gal的活性。 a：SA-β-gal活性（衰老细胞）：＝①的平均荧光强度 - ②的平均荧光强度 b：SA-β-gal活性（正常细胞）：＝①的平均荧光强度 - ②的平均荧光强度 ・通过比较上述a和b的值来评价SA-β-gal的活性。 另外，通过a减去b的差值可以确定细胞衰老所引起的SA-β-gal活性的变化。 荧光显微镜检测 ・首先，使用未添加SPiDER-βGal的衰老细胞进行荧光观察。 ・调整灵敏度（Gain等），直至来生自脂褐素的荧光（背景）不影响荧光图像为止。 ・在相同的成像条件下，再对添加了SPiDER-βGal的细胞或正常细胞进行荧光观察。 |
| Q6: 细胞固定后还可以对SA-β-gal进行染色吗？ |
| A6: 可以。如果固定细胞，则不需要用Bafilomycin A1预处理细胞，但是需要制备pH调节至6的Mcllvain Buffer。详细的操作请参考操作说明书。 |
| Q7: 请问是否有细胞固定后进行流式细胞仪操作的具体步骤？ |
| A7: 可以。但是请注意细胞固定可能会影响SA-β-gal（请参考下面的*2） 以下的实验例供作参考。 WI-38细胞固定后，进行SA-β-gal检测和γ-H2AX (DNA损伤标志物)的免疫染色。 <实验操作> (1) 将WI-38细胞播种至35 mm dish，37℃，5% CO2培养箱中过夜培养。 (2) 去除上清，加入2 ml 4% Pa raformaldehyde/PBS溶液，室温培养3 min*1。 (3) 用2 ml PBS清洗细胞3次。 (4) 添加2 ml SPiDER-βGal working solution *2, 37℃培养30 min*3。 (5) 用2 ml PBS清洗细胞2次。 (6) 加入2 ml 0.1% Tritox X-100/PBS, 室温培养30 min。 (7) 用2 ml PBS清洗细胞2次。 (8) 加入 2ml 1% BSA/PBS溶液，室温培养1 h。 (9) 用1% BSA/PBS溶液稀释过的抗γ-H2AX IgG(小鼠来源)，加入至细胞后室温培养1 h (10) 用2 ml PBS清洗细胞3次。 (11) 用1% BSA/PBS溶液稀释过的抗小鼠IgG(Cy5标记)，加入至细胞后室温培养1 h。 (12)去除上清，用2 ml PBS清洗细胞2次后进行荧光显微镜观察。 *1 细胞固定时间越长，对SA-β-gal活性的影响越高。*2 细胞固定操作有可能会降低SA-β-gal的活性。如果检测SA-β-gal时，荧光强度较弱，请尝试将SPiDER-βGal DMSO stock solution 稀释500-1000倍使用。通常SPiDER-βGal DMSO stock solution 建议用Mcllvaine buffer (pH 6.0)稀释2,000倍使用。 *3 培养时不使用5% CO2培养箱。细胞固定后使用5% CO2培养箱的话，缓冲液会变为酸性，从而使得内在性β-galactosidase的活性上升，导致背景升高，无法辨别衰老细胞和年轻细胞的内的SA-β-gal活性的差值。 <实验数据> 通过比较免疫染色前后的SPiDER-βGal的荧光强度，可以发现固定后的免疫染色过程中SPiDER-βGal的荧光强度降低了。 图2. 不同稀释倍率的SPiDER-βGal染色结果 (免疫染色后) 红色：SPiDER-βGal 蓝色：γ-H2AX <曝光时间: 1.5 s>通过将SPiDER-βGal工作溶液的稀释比从2000倍更改为666倍，可以确认通过免疫染色（固定化）降低的SPiDER-βGal荧光强度与免疫染色前的强度相当。 |
| Q8: 染色操作后发现荧光很弱，无法观察，请问是否有改善的方法？ |
| A8: 请确认如下三个注意事项。 ①使用的滤光片是否与染色试剂匹配。 <推荐的滤光片> · 荧光显微镜：激发(500-540 nm)，荧光(530-570 nm) · 流式细胞仪：激发(488 nm), 荧光(500-540 nm) ②各working solution是否为现配现用。 ③延长染色时间 添加SPiDER-βGal working solution后，培养30 min后无法观察到荧光的话，考虑延长至45-60 min再进行荧光观察。 |
| Q9: 确认含有SA-β-Gal的细胞染色后，是否可以进行细胞固定？ |
| A9: 可以。建议使用4%的多聚进行细胞固定。 |
| Q10: 培养基中的血清和酚红是否会影响检测？ |
| A10: 培养基中的血清和酚红对SA-β-gal的检测没有影响。 |
| Q11：衰老细胞和正常细胞没有差异时，应该怎么确认？ |
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A11： STEP1：优化显微镜的观察条件。 STEP2：如果优化观察条件仍无法解决，请对染色条件进行优化。STEP1＜优化显微镜的观察条件＞ 如果衰老细胞和对照组细胞之间的荧光强度没有差异，请按照以下步骤进行调整。 1. 观察对照组细胞，通过降低激发光强度，Gain值或缩短曝光时间等条件将仪器调节至可以观察到微弱荧光的状态。 (共聚焦显微镜：调整Gain值、激发光强度 落射型显微镜：调整曝光时间) 2. 慢慢增强激发光强度，延长曝光时间，观察衰老细胞的荧光变化，寻找到衰老细胞和对照组细胞之间的最大荧光差异的条件。 ·如果两者荧光没有差异，请参考STEP2。 ※请使用玻璃底的培养皿容器观察。 STEP2<染色条件的优化> 根据不同的细胞种类，可能需要调整SPiDER-βGal的染色时间和工作液浓度。 以下为最佳条件的参考数据。 染色时间：10-60 min 染色浓度：说明书中1/2-2倍的浓度 分别加入不同浓度的工作液，并调整不同的染色时间，寻找到衰老细胞和对照组细胞之间的最大荧光差异的条件。 *如果观察的细胞数少的话，有可能灵敏度不够。必要时，需要调整细胞数量
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| Q12.如何准备药物阳性对照组 |
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A12：参考如下案例 衰老诱导（阿霉素处理的WI-38细胞） 1.将第3代的WI-38细胞（1×10^6细胞/皿，MEM，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素）接种在10 cm培养皿中，并在5％CO2中于37℃培养箱中培养过夜。2.除去培养基，并用10 ml PBS洗涤细胞一次。 3.用无血清MEM制备0.2μmol/ L的阿霉素。 如果没有无血清的培养基，可以使用含血清的培养基。 4.向培养皿中加入阿霉素（10 mL），并在5％CO2培养箱中于37℃培养3天。 5.除去上清液，并用10 ml PBS洗涤细胞一次。 6.向培养皿中加入MEM（10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素），并在5％CO2恒温箱中于37℃培养3天。 7.除去培养基，并用10 ml PBS洗涤细胞一次。 8.胰酶消化细胞，分别用阿霉素和不用阿霉素处理。 |
| 固定细胞成像 1.在8孔ibidi中准备细胞进行测定，并在5％CO2恒温箱中于37℃过夜培养细胞。 2.除去培养基。 用PBS洗涤细胞一次。 向细胞中加入4％多聚 （PFA）/ PBS溶液，并在室温下孵育3分钟。 3.除去上清液。 用PBS洗涤细胞两次。 4.混合SPiDER-βGal工作溶液（2 mL）和1mg / mL Hoehst 33342（2μl）。 将混合溶液（200μl）加入孔中，并在37℃孵育30分钟。 *我们建议不要在固定细胞实验中使用5％CO2培养箱。如果在5％CO2培养箱中进行培养，则缓冲液的pH值可能会呈酸性。 酸性pH导致内源性β-半乳糖苷酶活性的背景升高，因此很难区分正常细胞和衰老细胞。 5.除去上清液。 用PBS洗涤细胞两次。 6.在荧光显微镜下观察细胞。
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