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- 上海信帆代做PCR实验
- 2025年12月22日
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实时荧光定量PCR代测
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上海信帆生物科技有限公司
上海信帆生物提供PCR实验代测，荧光定量PCR代测服务。客户只需要提供样本，其他所有试剂都由本公司提供。一般7天出结果，提供原始数据，分析数据，实验报告，实验室所用仪器型号，图片，动力扩增曲线。欢迎来电咨询。
Real -Time PCR，即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法，它是在PCR反应体系中加入荧光物质，并通过Real -Time PCR检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，终对实验数据进行分析处理的方法。Real -Time PCR自1996年由美国Applied Biosystems公司推出以来，广泛应用于生物研究的各个领域。目前主要有SYBR Green 染料、Taqman探针法两种。
PCR实验代测，荧光定量PCR代测服主要仪器及耗材
旋涡振荡器 ：上海青浦泸西仪器厂产品
手握式电动匀浆机：德国FLUKO 公司产品
低温冷冻离心机：Sigma（3K15）公司产品
Real-time检测仪：ABI （ABI-7300）公司产品
超纯水分离系统：美国LABCONCO公司
离心管及10μL、200μL、1000μL枪头等常规耗材均为国产；RNA提取过程中所需的离心管、枪头等耗材经过0.1%的DEPC水浸泡过夜，121℃灭菌30min，烘干后备用。
PCR实验代测，荧光定量PCR代测服实验室试剂的操作
1)所用的所有溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。
2)所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的-新鲜蒸馏的去离子水，用0.22μm过滤的，并且是高压灭菌。
3)在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像NaN3一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的NaN3不抑制扩增反应。
4)所用试剂都应该以大体积配制，实验一下看试剂是否满意，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。
5)所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。
6)新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。
7)样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。
PCR简介：
多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是美国 Perkin-Elmer/Cetus公司人类遗传研究室Mullis K. B.等人于1985年发明的一种快速体外DNA片段扩增技术，是八十年代分子生物学资源领域的一项革命性突破，被誉为分子生物学资源发展史上的又一里程碑。该技术一问世，就在分子生物学、医学、生物工程、法医学、考古学等领域得到快速而广泛的应用，并且对已建立的基因克隆、DNA序列分析等现代分子生物学技术的发展也起了巨大的推动作用。
PCR技术是一种模拟自然DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术（亦称无细胞分子克隆技术）。它以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸作为介导，通过DNA聚合酶促反应，在体外进行特异DNA序列扩增。其过程包括模板变性（denature）、引物退火（annealing）和用DNA聚合酶延伸（clongation）退火引物在内的重复循环系列，使末端被引物5’端限定的特异性片段成指数形式累积。由于在每一循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶DNA的拷贝数几乎呈几何级数增长。因此20次PCR循环将产生约一百万倍（220）的扩增产物，具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强的特点，并且具有从DNA粗制品和降解的 DNA模板中扩增靶序列的能力，这一点在生药鉴定应用中尤为重要。
PCR的原理类似于DNA的天然复制过程，关键是运用两个起始引物，分别为待扩增序列的相对的两条单链DNA结合，结合位点分别位于待扩增序列的两端，并且3’端相对，然后利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模仿体内的复制，在两个引物之间诱发聚合酶反应。PCR反应可以简述如下：
在微量离心管中加入适量缓冲液，加微量模板DNA，四种脱氧单核苷酸（dNTP），耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物，并有Mg2+存在。
1、加热使模板DNA在高温下（95℃左右）变性，双链DNA解开而变成单链DNA游离于溶液中。这是所谓变性阶段。
2、PCR的引物是两段人工合成的寡核苷酸链，长度为16－24个核苷酸残基，其顺序由被扩增的DNA片段两端的序列决定。这两段寡核苷酸 链分别与模板DNA的正链和负链互补，所互补的位点一个在被扩增序列的“上游”，一个在被扩增序列的“下游”。高温使模板DNA变性成单 链以后，温度降低，由于PCR反应体系中引物的拷贝数远远多于模板DNA的拷贝数，因而引物与模板 DNA形成复合物的机率要大大高于 模板DNA两条单链的重新结合。只要严格地控制复性的条件，复性过程是倾向于形成引物与模板的复合物的。这是退火阶段。
3、溶液反应温度升至中温（72℃），在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两 条双链。这是延伸阶段。
如此重复，改变反应温度，即高温变性，低温退火，中温延伸三个阶段。这三次改变温度为一个循环。每循环一次，使特异区段基因拷贝数扩大一倍，一般30次循环，基因放大数可达2n倍。可用公式
Y＝（1＋X）n
表示，式中Y＝DNA扩增倍数，X＝扩增效率，循环数为n。
如X＝100%，n＝20时，Y＝1048576倍。但实际扩增效率（X）不会达到 100%。
2 试验条件
本程序适用于自动PCR操作，可适用于大多数情况，所用酶是不含核酸外切酶活性的热稳定聚合酶，如Taq聚合酶等。
引物（各50pmol）
0.2mmol/L dNTPs（必须使用高质量的dNTPs，这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解，因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等）
模板DNA：约0.05～1mg基因组DNA或0.002～0.02mg质粒DNA
Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut）
10×PCR缓冲液（500mmol/L KCl，15mmol /L MgCl2，100mmol/L Tris·HCl，pH 8.3）
矿物油
电泳所需试剂
| 反应组分 | 提高产量 | 提高特异性 |
| 模板浓度 | 增加 | 减少 |
| 引物浓度 | 高至75 pmol | 低至15 pmol |
| 引物长度 | － | 增加 |
| dNTPs | 各1 mmol/L | 各20 mmol/L |
| Tris-HCl (10 mmol/L pH8) | pH高至10* | pH高至10* |
| MgCl2 | 高至4 mmol/L | 1.5 mmol/L |
| DMSO | － | 10%** |
| 甘油 | － | 2% |
| 甲酰胺 | － | 5% |
| Taq DNA聚合酶*** | 高至5U | 0.5U |
| 反应条件 | 提高产量 | 提高特异性 |
| 循环数 | 多35个 | 减至25个 |
| 变性* | 增至1 min | － |
| 引物退火** | 降至45℃ | 升至72℃ |
| 引物延伸*** | 在后期循环中延长 | 维持30s |
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