Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Clo

Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆试剂盒产品描述

本试剂盒是利用拓扑异构酶（Topoisomerase）高效快速连接DNA片段的原理进一步研发而成，与传统的T4连接酶相比，具有以下优势：1）快速，仅需1-5分钟即可完成连接反应。2）高效，无自连现象，阳性克隆率接近100%，无需设置蓝白斑筛选；3）操作简单，从连接到涂板仅需15-20min。操作过程省去冰浴、热激和1h复苏等。4）可连接长达10kb目的产物。

Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆试剂盒产品用途

A尾PCR产物的快速克隆。

克隆后PCR产物的快速测序【使用M13F/M13R引物】。

产品组分

组分编号

组分名称

产品货号（规格）

10907ES20（20T）

10907ES60（5×20T）

10907-A

pESI-T vector (30ng/µl)

20µl

5×20µl

10907-B

1kb control insert(40ng/µl)

5µl

5×5µl

10907-C

10×Enhancer

20µl

5×20µl

运输和保存方法

冰袋运输。-20°C保存，避免反复冻融。有效期一年。

注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆试剂盒使用方法

♣ Control DNA 片段的克隆实验
1）在无菌微量离心管中配制下列DNA溶液，以10µl为例。
10 ´ Enhancer

1µl

1kb control insert (40ng/µl)

1µl

pESI-T vector (30ng/µl)

1µl

ddH2O

7µl

2）混匀上述体系。于室温（20-30℃）反应5min。

【注】：连接反应不可于冰上进行。反应时间不要超过5min，一般1-2min即可完成连接反应，得到足够的重组子。

3）连接产物可直接转化或于-20℃保存。

4）全量10ml加入100ml感受态细胞，轻轻混匀，室温放置5min。

【注1】：也可取5ml连接液，加入50ml感受态细胞中（加入体积不超过感受态细胞体积的1/10)。

【注2】：通常使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置5min便可获得足够多转化子，如果感受态细胞效率较低时，可以按照冰浴热激的标准程序进行。

5）加300-500ml LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃180 rpm振荡培养10min。

6） 取200ml菌液涂板（含氨苄抗性的LB或SOC固体培养基），培养过夜（如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000 rpm 离心1min，吸弃掉部分上清，保留100ml，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）。



♣ 一般DNA片段的克隆实验
所插入片段为含A尾产物，利用常规Taq酶（Yeasen，Cat#10101-10107），或热启动型Taq酶（Yeasen，Cat#10110）， 或长片段DNA聚合酶（Yeasen，Cat#10107ES62）扩增得到的产物如无非特异性条带、引物二聚体可直接进行连接反应。

否则建议胶回收后使用。

【注】：a、PCR产物不能磷酸化。

b、如扩增模板为质粒，模板质粒会在后续实验中引起假阳性，因此推荐PCR产物进行胶回收后连接。

1）按照下表配制连接体系（以10µl为例*）

10 ´ Enhancer

1µl

pESI-T vector(30ng/µl)

1µl

插入片段**

0.5-8µl

ddH2O

To 10µl

【注】：* 可根据具体实验情况按照上述比例调整反应体系。

** 不同的插入片段所用量参考下表

插入片段大小（1kb）

最佳用量(ng)

0.1-1kb

20-50 ng

1-2kb

50-100 ng

2-5kb

100-200 ng

2）混匀上述体系。于室温（20-30℃）反应5min。

【注】：连接反应不可于冰上进行。反应时间不要超过5min，一般1-2min即可完成连接反应，得到足够的重组子。

3）全量10ml加入100ml感受态细胞，轻轻混匀，室温放置5min。

【注1】：也可取5ml连接液，加入50ml感受态细胞中（加入体积不超过感受态细胞体积的1/10)。

【注2】：通常使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置5min便可获得足够多转化子，如果感受态细胞效率较低时，可以按照冰浴热激的标准程序进行。

4）加300-500ml LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃180 rpm振荡培养10min。

【注】：通常商品化的感受态细胞不超过2kb插入片段情况下，10min复苏可以得到足够多转化子，如果感受态效率低或者插入片段长转化子少的情况下可以提高复苏时间到30-60min以得到更多的转化子。

5） 取200ml菌液涂板（含氨苄抗性的LB或SOC固体培养基），培养过夜（如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000 rpm 离心1min，吸弃掉部分上清，保留100ml，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）。

6）转化子的筛选鉴定
① 菌液PCR鉴定；

② 质粒大小鉴定：挑取单克隆，抽提质粒后可根据质粒大小进行鉴定。

③ 酶切鉴定：根据克隆实验设计，选择合适的限制性内切酶进行鉴定。

④ 测序分析：可选测序引物序列如下

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

【注】：本制品阳性率相当高，一般情况下，阳性克隆率接近100%，只要是长出来的菌落正常（不是污染的杂菌，转化子数量也不算太少），基本就是阳性克隆，因此插入片段不超过2-3kb的情况下可以不用鉴定直接挑1-2个菌去测序。

Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆试剂盒yb1539 PEpiCGS 前列腺上皮细胞生长因子 Prostate Epithelial Cell Growth Supplement 5 ml
yb1540 ObGS 成骨细胞生长因子 Osteoblast Growth Supplement 5 ml
yb1541 CGS 软骨细胞生长因子 Chondrocyte Growth Supplement 5 ml
yb1542 SGS 滑膜细胞生长因子 Synoviocyte Growth Supplement 5 ml
yb1543 NPCGS 髓核细胞生长因子 Nucleus Pulposus Cell Growth Supplement 5 ml
yb1544 HGS 肝细胞生长因子 Hepatocyte Growth Supplement 5 ml
yb1545 SteCGS 星形细胞生长因子 Stellate Cell Growth Supplement 5 ml
yb1546 StemGS 人胚胎干细胞生长因子 50X StemGS. Human Embryonic Stem Cell Growth Supplement 50X 10 ml
yb1547 StemGS-XF 无异种多功能干细胞生长因子 50X Xenofree Human Pluripotent Stem Cell Growth Supplement 50X 10 ml
yb1548 CMGS 心肌细胞生长因子 Cardiac Myocyte Growth Supplement 5 ml
yb1549 CEpiCGS 角膜上皮细胞生长因子 Corneal Epithelial Cell Growth Supplement 5 ml
yb1550 TGS 滋养层细胞生长因子 Trophoblast Growth Supplement 5 ml
yb1551 PAdDS 前脂肪细胞分化生长因子 Preadipocyte Differentiation Supplement
yb1552 PAGS 前脂肪细胞生长因子 Preadipocyte Growth Supplement 5 ml
yb1553 AdGS 脂肪细胞生长因子 Adipocyte Growth Supplement 5 ml
yb1554 OEpiCGS 卵巢上皮细胞生长因子 Ovarian Epithelial Cell Growth Supplement 5 ml
yb1555 MODS 间充质干细胞成骨分化生长因子 Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation supplement 5 ml
yb1556 MADS 间充质干细胞脂肪分化生长因子 Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation supplement 5 ml
yb1557 MSCGS 间充质干细胞生长因子 Mesenchymal Stem Cell Growth Supplement 5 ml
yb1558 MSCGS-sf 间充质干细胞生长因子 Mesenchymal Stem Cell Growth Supplement-serum free 5 ml