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| 识别位点 在不同反应缓冲液中的活性
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文献和实验水浴等。[实验试剂]限制性内切酶BstNI、模板DNA、Taq聚合酶、PCR引物(上游引物:5-CTAAGCCTTCCCTTTATCACC-3’;下游引物:5-TTCACAGTCGTGCTTGTTTCT-3’)、丙烯酰胺、酶消化缓冲液、电极缓冲液、上样缓冲液等。[实验方法]1.PCR扩增:PCR反应体系为20μl,含模板2μl(约50ng),引物各1.6μl,dNTP1.6μl(0.4mM),10×Buffer缓冲液2μl,Taq酶0.5U,加双蒸水至20.0μl;PCR反应条件为95℃2min,94℃30
家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点,如K-ras基因第12密码子的BstNI位点,第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段,在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段,野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增,而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。 变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradinent electrophoresis,DGGE) DGGE法分析PCR产物,如果突变发生在最先
。 突变体富集PCR法(mutant-enriched PCR)本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点,如K-ras基因第12密码子的BstNI位点,第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段,在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段,野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增,而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。 变性梯度凝胶电泳法(denaturing
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