小鼠骨髓间充质干细胞永生化+GFP/免疫荧光鉴定

细胞详述

 骨髓间充质干细胞是骨髓基质干细胞，对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）来支持造血。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潜能，能促进间充质组织的再生，如：骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质等组织。

在骨髓中，BMSCs占骨髓有核细胞总数的0.001%~0.1%，含量极低。而同时，由于组织工程需要大量的种子细胞，从啮齿类动物骨髓分离BMSCs的技术上的难度限制了许多实验的开展。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的BMSCs对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。

该细胞通过慢病毒转染的方式携带SV40+GFP基因。

细胞筛选

该细胞为稳定转染GFP的细胞，随细胞传代次数的增加，其GFP荧光强度会逐渐减弱。若实验要求需要维持荧光强度，可以加入嘌呤霉素进行再次筛选。         建议收到细胞后至少传3代，冻存留种后再进行筛选。

初次进行细胞筛选时，建议加入终浓度为1ug/ml嘌呤霉素的完全培养基维持培养，若无细胞漂浮或者漂浮较少，即可更换为含2ug/ml嘌呤霉素的完全培养基继续筛选，以此类推，至最高药物浓度为5ug/ml。若筛选过程中，漂浮细胞大于60%，则停止筛选，换成正常培养基培养，至细胞密度约80%，可继续加入同浓度嘌呤霉素进行筛选。当加入5ug/ml嘌呤霉素时细胞正常增殖，可停止筛选，用不含药完全培养基正常培养。

细胞特性

1） 组织来源于实验动物的正常骨髓血组织。

2） 细胞鉴定：CD44免疫荧光染色为阳性。

3） 经鉴定细胞纯度高于90%。

4） 不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5） 细胞生长方式：长梭形细胞，不规则细胞，贴壁培养。

 产品的运输和保存

视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。

1) 1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。

2) T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。

推荐培养基

我们推荐使用iCell原代间充质干细胞培养体系（产品编号：PriMed-iCELL-012）作为体外培养原代骨髓间充质干细胞的培养基。

名称	体积	浓度	保存条件
原代间充质干细胞细胞基础培养基	500ml	1×	4℃、避光
原代间充质干细胞培养添加剂	5ml	100×	-20℃、避光
胎牛血清（FBS）	50ml	终浓度10%	-20℃、避光
双抗（青霉素/链霉素，P/S）	5ml	100×	-20℃、避光

产品使用

1) 本产品仅能用于科研

2) 本产品未通过直接用于活体动物和人的审核

3) 本产品未通过用于活体诊断的审核

操作流程

复苏

1将恒温水浴锅中的水预热到37℃；

2准备一支15ml离心管，加入5ml含10%FBS的完全培养基，放入37℃水浴锅中预热；

3戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率；

4将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm离心5min；

5准备一个T-25培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入4ml完全培养基；

6离心完成后弃去上清，用1ml完全培养基重悬细胞后，转入T-25细胞培养中，混匀后转入CO2培养箱中培养静置。

注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。

传代     （细胞传代建议一传二）

1 当细胞汇合度达到85%以上时，可进行传代。

2 在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；

3 向培养瓶内加入3ml无菌的1×PBS 后，水平放置培养瓶，使PBS能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃PBS；

4 向瓶内加入消化液1ml，浸润底面后放入37℃ CO2培养箱中孵育1~2min；

5 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2ml含10%FBS的完全培养基中，将悬液吸入15ml离心管；

注：如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化：

① 准备一个无菌的15ml离心管，加入2ml含10%FBS的完全培养基；

② 将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）；

③ 向之前消化的培养瓶中加入1ml胰酶继续消化2min左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入2ml含10%FBS的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。

6  1000rpm离心5min；

7  准备两个新的T-25培养瓶，各加入4ml完全培养基。

8  离心完成后，弃上清，用2ml完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入2个T-25培养瓶，每个培养瓶各1ml；

9  水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于37℃，5%CO2培养箱中静置培养。

冻存   （细胞冻存建议每瓶T25冻一支）

1  ( 1~6）参照传代步骤

7  离心完成后，弃上清，用1mL冻存液重悬细胞沉淀，然后转入1.8ml冻存管中；

8  将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；

9  第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。

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