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文献和实验细胞(见 11.3.1 节 1)。Constant System,Warwick,UK )。 ( 5 ) 固定化 pH 梯度(IPG;线性和非线性 pH 梯度 3~10,长 18 cm;AmershamPharmacia Biotech)。 ( 6 ) IPGphor 设备:分离电泳聚焦蛋白质(Amersham Pharmacia Biotech) 。 ( 7 ) Protean I I:用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE ) (BioRad
惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加3倍,而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。而短探针不需用促进剂,因其复杂度低和分子量小,短探针本身的杂交率就高 。 硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。这是一种多聚胺,平均分子量为500000。另一种常见的促进剂是聚乙二醇(PEG),PEG分子量小(6000~8000)、粘度低、价格低廉,但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些条件下5%~10%硫酸葡聚糖效果较好,若用5%~10
【交流】大家来看看我的ISH protocol!哪里有问题么?
ul 50%硫酸葡聚糖 探针1:1000-1:3000 约5-20nM 盖parafilm,置于湿盒中 7 SSC中洗 RT 5* SSC 5 min 1*SSC 5 min 0.2*SSC 5 min 8 10%热失活GS in pbs(含0.1%Tween20) 15min RT 9滴加anti-DIG-AP(Tris缓冲液 1+2%BSA+0.15%Triton)1:800稀释 2h 37度 10
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