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- 2025年08月13日
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USER™ Enzyme
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♦ PCR 产物的克隆
♦在 DNA 的尿嘧啶处产生缺口
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概述
USER™（尿嘧啶-特异性切除试剂）酶在尿嘧啶位置产生一个单核苷酸缺口（1）。USER 酶是尿嘧啶 DNA 糖基化酶（UDG）和 DNA 糖基化酶-裂解酶 Endo Ⅷ的混合物。UDG 催化尿嘧啶碱基的切割，形成一个脱碱基（脱嘧啶）位点，但保持磷酸二酯骨架结构完整（2，3）。Endo Ⅷ的裂解酶活力使脱碱基位点 3' 和 5' 端的磷酸二酯键断裂，释放无碱基的脱氧核糖（4，5）。
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来源
分别从E. coli K-12 菌株纯化 Endo Ⅷ和尿嘧啶 DNA 糖基化酶。该菌株的质粒上含有编码这两种酶的基因。
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反应条件
PCR 反应缓冲液，37 ℃温育。
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质保声明
无核酸内切酶和外切酶污染。
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单位定义
1 单位指在 10 μl 反应体系中，37 ℃条件下，15 分钟使 10 pmol 的含有单一尿嘧啶碱基的 34bp 寡核苷酸双链产生切刻所需要的酶量。
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活性检测
在 10 μl 反应体系中，在含有 10 pmol 荧光标记的寡核苷酸双链的 1X T4 DNA 连接酶缓冲液中，37 ℃温育 15 分钟。
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浓度
1,000 units/ml。
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贮存条件
33 mM KCl，33 mM NaCl，12.5 mM Tris-HCl（pH 7.7），0.3 mM EDTA，1 mM DTT，160 μg/ml BSA和 50% 甘油。
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热失活
无。
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参考文献
(1) Bitinaite, J. et al. (2007) Nucleic Acids Res., doi:10.1093/NAR/GKM041.
(2) Lindhal, T. et al. (1997) J. Biol. Chem., 252, 3286–3294.
(3) Lindhal, T. (1882) Annu. Rev. Biochem., 51, 61–64.
(4) Melamede, R.J. et al. (1994) Biochemistry, 33,1255–1264.
(5) Jiang, D. et al. (1997) J. Biol. Chem., 272, 32230–32239
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