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♦蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶 ♦人源,重组蛋白(S.frugiperda Sf9)
概述
CDK2-cyclinA是细胞周期蛋白依赖性激酶家族中的一个成员,能调控真核细胞周期。细胞周期中的每一个时期表达不同的细胞周期蛋白依赖性激酶复合物,来磷酸化并且调控下游底物。 CDK2- cyclinA是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,由催化亚基CDK 2和其正调控亚基- 细胞周期蛋白A (cyclinA) 组成。CDK2需要与细胞周期蛋白结合才有活性,并且CDK2的激活还需要在160位上的苏氨酸磷酸化,这一步是在CDK活化激酶(CDK activating k i n a s e CAK) 作用下完成的。在脊椎动物中中,CDK2-cyclin A复合物在细胞周期的S期具有活性(1)。
在160位上的苏氨酸磷酸化的CDK2是在重组大肠杆菌中表达的。人GST-CDK2(亚型1)和酿酒酵母(S.cerevisiae)GST-Cak1共同表达,纯化后的蛋白质不含GST-tag。突变了N173M的人细胞周期蛋白A(173-432)也是在大肠杆菌中表达的,并且纯化后也不含tag。所有蛋白编码序列都是在T7表达系统的控制下克隆的(Dr. D. Barford惠赠)(3)。
反应条件
1X CDK2-cyclin A反应缓冲液[50 mM Tris-HCl, (pH 7.5 @25°C), 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 2 mM DTT和0.01 % Brij 35],加入200 μM ATP和终比活性为100-和500μCi/μmol的γ-放射性标记的ATP,30°C温育。