半固体营养琼脂

基础半固体营养琼脂
绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。
半固体营养琼脂 制备方法：
1. 培养同源细胞（未克隆前时的同一细胞）至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24~48小时后，吸出所有培养液。
2. 离心：3000~4000/分离心10分钟，吸取上清液。
3. 滤过：再经直径0.22μm滤孔的滤膜过滤，低温冻存贮备用；用时取1分适应培养基+2培养基混合使用。
生长因子绝大多数哺乳类胚胎神经元有严格的营养要求，若不能提供适宜的生长因子或合适的因子组分，将会使绝大多数神经元在体外培养的数天中死亡。解决这一问题有两条思路，一是让培养细胞提供自己的营养因子，二是在半固体营养琼脂 中加入纯的生长因子。如果细胞混合物能在高密度时生长，所需的生长因子便会积累到可观的数值，尤其当培养基很少变化时。若某种细胞混合物生长时有很少的营养需求，可保持培养基在一段时间里不作任何变动，以使营养（生长）因子积累，而最后促使所需要的细胞类型能够生长。但是，这种对营养（生长）因子自身倚赖性亦有弊端，因为通常在混合细胞群体中细胞很难有同比例增殖，某些细胞会因生长条件的贫乏而受限制。另外，这种方法只能进行相当高密度的细胞培养。因为培养基的条件在细胞的较低密度时变的不够有效。不过某些时候纯化神经元群体的低密度培养可用条件培养基（经过了高密度培养）进行，或在胶质上生长的神经元所用过的培养基来支持。
满足神经元营养需求的第二条途径是向培养基中加入生长因子。通常用于组培的通用适宜因子是神经生长因子NGF。不过，只有少数对这种蛋白质有反应的细胞类型的细胞才能生长。
半固体营养琼脂 注意事项
1 用L-多聚赖氨酸（0.1mg/ml） 包被培养板后，要待其干后才能接种，因为其对神经元有毒性。L-多聚赖氨酸（0.1mg/ml）能回收再利用。
2 取脑组织时动作尽量要快，并且尽量低温操作。
3 分离皮层和海马时，要尽量分离脑膜和血管，否则有大量的成纤维细胞。
4 用吸管轻轻吹打细胞时，尽量不起泡沫，以免损伤神经元。
5 接种细胞的过程，动作要快，以免细胞聚集。
6 接种细胞后，24h勿移动，以免影响细胞贴壁。
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