O~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的检测

O~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的检测 说明书

~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(O~6-alkylguanine-DNA alkyltransferase，AGT)是DNA中O~6-烷基鸟嘌呤的主要修复蛋白，它能将烷化D N A 分子上的O 6- AGT的甲基转移到自己身上, 使受损伤的碱基得到修复, 而酶自身失去活性。本方法的原理就是通过测量转移到0 6 一AGT 上3H –烷基的放射性来反映酶的活性。

O~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的检测 说明书标本的收集：采用密度梯度离心法提取人外周血淋巴细胞。使用Hank’s液将血样1：1稀释从冰箱中取出4℃避光保存的淋巴细胞分离液。摇匀后在无菌状态下加入刻度离心管中，将盛有分离液的离心管放入37℃水浴中平衡。用吸管将稀释的血液沿离心管壁徐徐加到分离液面上，用力要轻，避免血液冲入分离液中，使得稀释血重叠在分离液面以上，拧紧管盖。稀释血与分离液的高度比在1：2，将离心管放置于水平离心机中，室温下 2000rpm离心20min。离心结束后可见管内分为四层，从上至下分别为：血浆层（含部分血小板）、白膜层（含单个核细胞及少量血小板）、分离液层、粒细胞及红细胞层。将吸管轻轻穿过血浆层至白膜层，沿离心管周缘吸出血浆层与分离液层界面间的白膜层细胞，置于新离心管中。加吸出体积5倍以上的Hank’s液体，用吸管吹打均匀，避免产生气泡，液拄高度不要超过离心管的2/3。室温1500rpm离心10min，快速倾倒出上清液。用Hank’s重悬细胞，注意吹打均匀。室温下1500rpm离心5min，洗涤两次。沉淀用1毫升PB缓冲液稀释，放入离心管，超声30秒，取出混均，再进行超声30秒。加入PMSP(8.7毫克/毫升 乙醇中)，4度16000RPM离心20分钟，上清液待测。
上清液一部分测蛋白定量，另一部分测O~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性。

O~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的检测 说明书标记物的制备:20克小牛胸腺DNA物质溶解于5毫升PH7.2 0.2M/L的二甲钠，1Mm/L EDTA,加入1mCi的3H-methylnitrosourgamethylated 37度2小时。加入12毫升冷乙醇-20度过夜，取出然后于0℃ 50O0r/min 离心3 0 min,弃上清。
沉淀加5 ml TE 缓冲液(10 m M/L TRIS lm M/L EDTA , pH 8.0)溶解, 再加入12ml 冷无水乙醇-20℃过夜在0℃ 5000r/m in 离心30min.弃上清。
沉淀加入5ml TE 缓冲液, 混匀, 于80 ℃水浴l6h. 室温放置1.5h , 在4 ℃ 用TRIS EDTA 缓冲液透析24h(10 m M/L Tris , 1M/L NaCL, 1m M /L EDTA , p H 8.0)。再用TE 缓冲液透析一天,上午、中午、下午各更换一次透析液, 透析后3H-methylnitrosourgamethylated 一D N A 分装,-2 0 ℃ 保存备用.
二甲苯闪烁液：0.02%P0P0P 0.4%PPO于500毫升的二甲苯。
缓冲液：50mM Tris-HCL, 3nM二硫苏糖醇 ,1mM EDTA, 8.7mg/ml PMSF. 500ml.

O~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的检测操作步骤
测量管 对照管
标本 100 ---
缓冲液 --- 100
标记物 100 100
37度 120分钟
BSA 100 100
O~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的检测 说明书 高氯酸(4M) 100 100
混均
高氯酸（1M） 200 200
75度 40分钟 12000转/分 20分钟去上清
高氯酸(1M) 400 400
混均

NAOH(0.01M) 100 100
混均
闪烁液 3000 3000
混均，测量.

按下面公式计算出O~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性

酶活性(fmol/mg prot)=(样品放射性计数值—对照管放射性计数值）/同位素比活性*45
。
范围：135-330 fmol /mg 中文名称：人血管活性肠肽(VIP)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human Motilin,MTL ELISAkit
中文名称：人胆囊收缩素/肠促胰酶肽(CCK)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human cholecystokinin,CCK ELISAkit
中文名称：人Ⅲ型前胶原肽(PⅢNP)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human N-terminal procollagen Ⅲ propeptide,PⅢNP ELISAkit
中文名称：人Ⅱ型胶原(Col Ⅱ)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human Collagen Type Ⅱ,Col Ⅱ ELISAkit
中文名称：人Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human Collagen Type Ⅰ,Col Ⅰ ELISAkit
中文名称：人Ⅰ型前胶原羧基端肽(PⅠCP)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human procollagen Ⅲ N-terminal peptide,PⅢNT ELISAkit
中文名称：人透明质酸(HA)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human Hyaluronic acid,HA ELISAkit
中文名称：人Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human Collagen Type Ⅳ,Col Ⅳ ELISAkit
中文名称：人Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human Collagen Type Ⅲ,Col Ⅲ ELISAkit
中文名称：人层连蛋白/板层素(LN)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human Laminin,LN ELISAkit
中文名称：人纤连蛋白(FN)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human Fibronectin,FN ELISAkit
中文名称：人NOGO-A抗体(Nogo-A Ab)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human anti-Nogo-A antibody,NOGO-A Ab ELISAkit
中文名称：人抗组织转谷氨酰胺酶抗体IgA(tTG-IgA)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human Anti-tissue tranGSlutaminase IgA,tTG-IgA ELISAkit
中文名称：人抗存活素抗体/生存蛋白(Surv)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human anti-Survivin antibody,Surv ELISAkit
中文名称：人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子抗体(GM-CSF Ab)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human anti-Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating
中文名称：人抗肌联蛋白抗体(TTN)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human Anti-titin Antibody,TTN ELISAkit
中文名称：人抗突触前膜抗体(PsmAb)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human anti-presynaptic membrane antibody,PsmAb ELISAkit
中文名称：人血管紧张素Ⅱ受体2抗体(AT2R-Ab)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human Angiotensin Ⅱ Receptor 2 antibody,AT2R-Ab ELISAkit
中文名称：人血管紧张素Ⅱ受体1抗体(ATⅡR1)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human angiotension Ⅱ receptor 1 Antibody,ATⅡR1 Ab ELISAkit
中文名称：人血管紧张素Ⅰ受体抗体(ANG-ⅠR)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human angiotension I receptor Antibody,ANG-ⅠR antibody
中文名称：人卵清蛋白特异性IgG(OVA sIgG)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human ovalbumin specific IgG,OVA sIgG ELISAkit
中文名称：人抗钙调素特异抗体(CAM-ab)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human anti-calmodulin specific antibody,CaM-ab ELISAkit
中文名称：人甲状腺非肽激素抗体(THAA)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human thyroid hormone autoantibodies,THAA ELISAkit
中文名称：人抗类固醇生成细胞抗体(SCA)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human steroid producing cell autoantibody,SCA ELISAkit
中文名称：人粒细胞特异性抗核抗体(GS-ANA)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human granulocyte specific antinuclear antibody,GS-ANA
中文名称：人抗信号识别颗粒抗体(SRP)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human signal recognization particle antibody,SRP ELISAkit
中文名称：人封闭抗体(BA)ELISA试剂盒价格96t/48t 英文名称：Human Blocking antibody,BA ELISAkit